Объяснительная записка в ифнс образец: Образец пояснительной записки в налоговую 2020 и 2021

Содержание

Как написать пояснительную записку по требованию налоговой инспекции

Взаимодействие с налоговыми органами не всегда бывает неприятным. Осуществляя камеральную проверку сведений, предоставленных в ходе отчетности или по иным основаниям, довольно часто инспекции требуются дополнительная информация о предоставленных вами данных. Для этого она запрашивает пояснительную записку на основании п. 3 ст. 88 НКРФ.

Запрос на предоставление сведений может быть направлен по причине каких-либо ошибок и неточностей в отчетности, при значительных изменения в корректировочных декларациях или при обнаружении противоречивых сведений. Также инспекция проверит и попросит обосновать каждую “убыточную” декларацию.

В этих случаях налоговая ожидает ваших разъяснений по сложившейся ситуации, то есть предоставляет возможность оправдаться и указать на какие-либо значимые факторы, которые способствовали возникновению данного обстоятельства.

Запрос пояснительной записки — это еще не так серьезно, как получение требования. Если ответ все же не будет передан в течение пяти дней, то штрафных санкций не последует. Но и игнорировать данный запрос не стоит, ведь тогда инспекция на свое усмотрение интерпретирует ситуацию и сможет, например, доначислить налог или наложить иные санкции. Для избежания негативных последствий нужно лишь грамотно сформировать ответ.

Ответ формируется письменно на бумаге или в форме электронного документа с ЭЦП (электронно-цифровой подписью).

Предоставляется следующими способами:

  • лично посещаем инспекцию. Подготовьте два экземпляра пояснений для того, чтобы на вашем экземпляре инспектор сделал отметку о принятии;
  • направляем по почте заказным письмом с описью.
  • передаём по ТКС (телекоммуникационным каналам связи). Особенно это касается запросов по декларациям НДС. Так как форма сдачи отчетности предусмотрена только электронная, то и все взаимодействие по НДС с инспекцией идет через ТКС. Бумажный вариант не будет принят и запрос в таком случае не будет считаться исполненным. (Письмо ФНС от 27.01.2017 г. N ЕД-4-15/1443)

Очень часто на практике ИФНС отправляет запросы в электронной форме и по иным вопросам, не связанным с НДС. Это происходит потому, что в большинстве случаев подключаясь к электронной отчетности, компания приобретает полный пакет услуг, который включает передачу всей отчетности во все органы: ИФНС, ПФР, ФСС и Росстат. В связи с чем у ИНФС есть возможность общаться с налогоплательщиками по средствам ТКС без ограничений круга вопросов. Это очень удобно, так как существенно экономит ресурсы компании, когда не нужно дополнительно посещать инспекцию и все запросы можно отработать на месте.

Если есть какие-то физически подтверждённые данные, обосновывающие факт ошибок и нарушений, то все имеющиеся сведения также стоит приложить к пояснительной записке.

Если запрос пришёл по поводу неточности в отчётности, то вместо пояснений можно сразу предоставить уточнённую декларацию.

Как должна выглядеть пояснительная записка.

Напомним, что формального бланк для пояснительной записки нет. Вы лишь сообщаете необходимые сведения в свободной форме. Но лучше если это будет официальный бланк компании. Если такого бланка еще нет, то в правом верхнем углу указывается куда и на чьё имя сформирован ответ, далее название Вашей организации, ИНН, КПП, ОГРН, адрес регистрации и ФИО ответственного лица. Затем ниже идет основная часть, в тексте которой раскрывается суть вопроса и даются пояснения. Здесь рекомендуется сделать ссылку на номер и дату запроса и после этого далее по тексту указать достоверные сведения и иную необходимую информацию. В конце можно указать список прилагаемых оправдательных документов. После необходимо проставить дату и подпись ответственного лица, составившего пояснения.

Самые распространенные запросы и пояснения.

 

Разберем подробнее какие нарушения очень часто вызывают вопросы у инспекторов в ходе камеральной проверки отчетности.

  1. Убытки.

Самым распространенным является запрос о пояснении получения убытка в деятельности компании. Для вновь созданных фирм немного проще оправдаться, так как деятельность еще не до конца налажена и могут быть простои, а также сбои в производстве или реализации продукции, отсутствие клиентской базы и иные обстоятельства, влияющие на получение прибыли. К давно существующим фирмам будет более пристальное внимание. Налоговая может заподозрить умышленное занижение прибыли. Поэтому важно в пояснении сделать как можно более подробные описания причин возникновения убытков. Возможно были большие вложения в производство: ремонт, модернизация, либо деятельность пошла на спад в связи с кризисом на рынке предлагаемых товаров или услуг. Чем больше оправданий вы найдёте, тем вероятнее, что налоговая примет вашу сторону и не наложит санкции.

  1. Разная выручка.

Довольно часто приходится разъяснять расхождение данных по выручке в декларациях по НДС и налогу на прибыль. Бухгалтерский и налоговый учет имеет ряд отличий при исчислении данного показателя (выручки). В связи с этим, суммы в данных декларация могут отличаться, например, на сумму штрафов (ст. 250 НКРФ). В ответе так и пишем, что, в связи с различными способами определения выручки, показатели имеют разное значение.

  1. Зарплата и НДФЛ.

Проверяя отчетность по сотрудникам, инспектора могут заинтересовать данные о начисленной заработной плате, если её размер ниже МРОТ (минимальный размер оплаты труда). В таком случае оправданием послужит штатное расписание и трудовой договор, в котором будет указано, что работник трудится на ½ ставки, неполный день или совмещает должности. Корректность исчисления НДФЛ зависит от правильного начисления заработной платы. В основном возникают технические ошибки и сбои при автоматическом формировании данных. Важно внимательно отслеживать начисления в программах учета и своевременно корректировать их.

Если ошибка была пропущена и инспекция это выявила, пишем пояснение, в котором указываем на техническую составляющую. Делаем перерасчёт, предоставляем уточнённые сведения и, по необходимости, доплачиваем разницу в бюджет. К ответу можно приложить платёжное поручение, подтверждающее факт оплаты образовавшейся задолженности.

  1. Снижение объёмов налоговых отчислений.

Данная ситуация тоже вызовет интерес у налоговых органов. Пояснить почему налоговая нагрузка уменьшилась нужно обязательно, иначе есть вероятность попасть под выездную проверку.

Объективных причин может быть несколько:

  • сокращение сотрудников. Это приводит к снижению налогов и взносов с заработной платы. Причины сокращений также могут быть разными: изменение штатного расписания, снижение объемов деятельности. Главное чтобы данные изменения были экономически обоснованными.
  • расширение деятельности, соответственно увеличение затрат, что влияет на налог на прибыль. Например открытие нового офиса или филиала.
  • увеличение уровня затрат при повышении цен на сырье или материалы, используемые в производстве.
  • снижение спроса на продукцию или услуги и, соответственно, выручки при прежнем уровне затрат.
  1. НДС

Здесь ошибки бывают, в основном, технического характера, когда в Книгу покупок или продаж попадают не все счета-фактуры. В связи с этим искажается налоговая база и неверно рассчитывается сам налог. Также возможно наличие “человеческого фактора”, когда данные вносятся несвоевременно или невнимательно и допускаются ошибки. В пояснениях пишем все как есть. Делаем перерасчет, подаем уточнённую декларацию и по необходимости доплачиваем налог. Примечание: сначала подаём “уточнёнку”, а потом пишем пояснения с приложением копии корректировочной декларации либо с указанием даты корректировки. При наличии прикладываем копию платёжного поручения.

ВАЖНО: пояснения по НДС предоставляются только в электронном виде! 

Заключение

При получении запроса о предоставлении пояснений, не зависимо от причин возникновения ошибок и неточностей, не стоит оставлять его без внимания. Нужно грамотно и своевременно сформировать ответ с необходимой информацией и не опасаясь написать все основания возникновения ошибок. Даже если Вам кажется, что причина не объективна и инспекция не примет ее во внимание, используйте все возможности, так как неблагоприятные ситуации на рынке товаров и услуг в условиях нестабильной экономики возникают нередко. Также никто не застрахован от “человеческого фактора”: невнимательности сотрудника или отсутствии лица, ответственного за составление отчетности по причине болезни. Да и техника иногда подводит и выдает сбои в программном обеспечении. Любой фактор может сыграть вам на пользу и поможет избежать санкций либо значительно смягчит наказание.

Автор: Сорочкина Екатерина

Пояснение в налоговую по убыткам. Образец и бланк 2021 года

Пояснение в налоговую службу по убыткам необходимо дать в том случае, если из этого надзорного органа поступило соответствующее требование.

Зачем писать пояснение

Довольно часто у налоговиков по результатам сданной налоговым агентом отчетности появляются различные вопросы. В таких ситуациях инспекторы высылают в организацию письмо с просьбой дать пояснения. Наиболее часто проблемы возникают в связи с какими-либо противоречиями, неточностями и ошибками, выявленными в декларациях, несоответствиями между данными, имеющимися в налоговой и указанными в отчетной документации предприятием, а также из-за отсутствия прибыли по результатам работы в отчетном периоде, а уж тем более при явных убытках.

ФАЙЛЫ
Скачать пустой бланк пояснения в налоговую по убыткам .docСкачать образец пояснения в налоговую по убыткам .doc


Последнее вызывает у налоговиков вполне обоснованные сомнения, поскольку основной целью работы любой компании является извлечение выгоды, а если таковой по итогам предоставленной декларации не имеется, то это может обозначать попытки скрыть доход для уклонения от уплаты налогов, что особенно актуально при систематических убытках.

Не следует забывать и о том, что налог на прибыль является одним из главных источников формирования бюджета, а это значит, что налоговики следят за перечислениями по этому налоговому направлению особенно пристально.

Что может привести к убыткам

Отсутствие доходов и убытки организаций – не такое уж и редкое явление, как может показаться непосвященному человеку. Они могут быть связаны с самыми разными обстоятельствами. К ним может привести общий финансовый кризис, спад спроса на продукцию (в том числе из-за сезонных факторов), превышение трат и расходов над прибылью (например, при покупке дорогостоящего оборудования, крупных ремонтных работах и т.п.), проблемы в производстве, неэффективный менеджмент компании, перепрофилирование предприятия и освоение новых рынков и многие другие причины.

Как проверяется организация

Для того чтобы проверить и проконтролировать то или иное предприятие, вызвавшее сомнения в финансовой и налоговой «чистоте», в налоговых службах формируются специальные, так называемые «убыточные комиссии».

В соответствии с законодательством их основная задача – простимулировать организации самостоятельно разобраться в причинах убытков и предотвратить их дальнейшее появление.

Особое внимание комиссия уделяет тем компаниям, которые на протяжении двух предыдущих лет показывали в своих декларациях отсутствие прибыли, а также тем, которые делают слишком незначительные налоговые отчисления (у специалистов налоговой есть средние показатели по доходам и налоговым платежам в том или ином отраслевом направлении бизнеса).

Для достижения своих целей работники убыточной комиссии не только пишут требования о даче пояснений по убыткам в организации, но и при особо сомнительных ситуациях вызывают «на ковер» руководство фирм (обычно директора и главного бухгалтера).

Можно ли не давать пояснений по убыткам

Пояснения об убытках давать нужно обязательно. Причем делать это следует в письменном виде и не позже чем через пять дней после получения соответствующего требования из налогового органа.

Несмотря на то, что никакого наказания за отсутствие пояснений в законодательстве РФ не предусмотрено, игнорирование писем налоговиков может иметь весьма печальные последствия для организации. В частности, может произойти доначисление налогов или могут быть приняты какие-либо меры административного воздействия. Но самое неприятное, что также вполне возможно – отсутствие логичной и ясной картины финансовой деятельности компании может привести к выездной налоговой проверке, при которой будет «перетрясена» вся документация за последние три года, а это уже чревато совершенно иными, более серьезными санкциями. Замечено: в график выездных проверок предприятия с регулярными убытками налоговики включают весьма охотно.

Как писать пояснение по убыткам

Пояснение можно писать в произвольном виде. Главное, чтобы структура документа отвечала нормам и правилам составления деловой документации, а сам текст пояснительной записки был четким, понятным и полностью отражал реальное положение дел на предприятии.

Если к убыткам привели какие-то события, свойственные для всей экономики: например, кризис, то тут иногда достаточно просто грамотно это сформулировать, указав на спад спроса и вынужденное снижение цен (приложив к пояснению отчеты, прайсы и прочие свидетельствующие об этом бумаги). А вот если причиной отсутствия прибыли стали, к примеру, большие траты налогоплательщика при одновременном снижении продаж, то эти сведения надо подкрепить более серьезными документами (договорами и соглашениями о расторжении договоров, актами, налоговыми выписками и т.д.). По возможности нужно предоставить также детальный отчет по расходам и доходам.

Если убытки возникли вследствие каких-либо чрезвычайных ситуаций (пожаров, затоплений, краж и т.п.), то к пояснению нужно обязательно прикрепить справки из соответствующих государственных структур (полиции, МЧС, управляющей компании и проч.).

Не лишним в документе станет и описание мер, которые работники организации предпринимают для предотвращения дальнейших убытков (они укажут на желание руководства предприятия исправить неблагоприятную ситуацию).

Следует отметить, что у крупных компаний пояснения порой достигают объема в несколько десятков страниц, что объяснимо, поскольку чем точнее пояснительная записка, тем меньше претензий со стороны налоговиков может появиться в дальнейшем и тем ниже вероятность выездной налоговой проверки.

Как оформить бланк

Документ можно писать вручную, но лучше все же напечатать на компьютере. Для распечатки допустимо взять обычный лист бумаги или же бланк с реквизитами и логотипом фирмы. Пояснение нужно делать обязательно минимум в двух экземплярах, один из которых отправить по месту назначения, второй оставить у себя. Информацию о записке нужно обязательно внести в специальный учетный журнал – сюда достаточно поставить его номер и дату.

Кто должен подписать документ

Пояснение пишется от лица руководителя организации или работника, временно находящегося на его месте. Соответственно, именно директор и должен поставить под письмом свой автограф. Хорошо, если в документе распишется и главный бухгалтер предприятия, как материально-ответственное лицо, которое формирует финансовую и налоговую отчетность.

Как отправить пояснение

Если компания подает отчетность в налоговую службу в электронном виде, то и пояснения нужно передавать в таком же формате. Однако, если налоговый агент пользуется правом подачи отчетной документации на бумажных носителях, то допускается формировать пояснительную записку в «живом виде». Затем ее можно отнести в налоговую лично, передать с представителем (у которого на руках есть соответствующая доверенность) или же переслать по почте.

Образец пояснения в налоговую по убыткам

Если налоговая прислала вам требование о даче пояснений по убыткам, возьмите на вооружение выше приведенные рекомендации и посмотрите пример – на их основе вы без труда напишите собственный документ.

  1. Сначала в пояснительной записке нужно указать адресата (справа или слева вверху бланка) т.е. ту налоговую, куда будет отправлено данное письмо.
  2. Затем указывается отправитель: название фирмы, ее реквизиты и контактные данные,
  3. После этого переходите к основному разделу. Первым делом укажите здесь ссылку на требование о даче пояснений, пришедшее из налоговой.
  4. Далее как можно подробнее словами опишите обстоятельства, в связи с которыми образовались убытки.
  5. После этого переходите к объяснениям в цифрах. Здесь нужно предоставить данные о доходах и расходах, а также внести ссылки на документальные подтверждения (указав их наименование, номер и дату).
  6. После того как пояснительная записка будет сформирована, не забудьте ее подписать.

Причины низкой налоговой нагрузки: образец пояснения для ИФНС

Штатный бухгалтер после вызова на комиссию по причине низкой налоговой нагрузки посоветует руководству пойти на уступки ИФНС и исполнить требования инспекторов. В результате даже начинающий бизнес рискует получить большую налоговую нагрузку. При этом реальные требования по налоговой нагрузке так никто и не изучит. А ведь знание этих требований позволяет дать грамотное объяснение низкой налоговой нагрузки, что в большинстве случаев способно решить проблему.

В процессе налогового контроля «камеральщики» используют очень важный показатель – налоговую нагрузку.

Что такое налоговая нагрузка и как ее рассчитать

Низкая налоговая нагрузка, как правило, является поводом для:

  • вызова компании на комиссию по легализации налоговой базы;
  • требования неопровержимых доказательств того, что причины низкой налоговой нагрузки – объективны.

Налоговый разрыв по среднеотраслевой нагрузке – один из наиболее важных критериев при отборе компаний на выездные проверки.

«Основания для выездной налоговой проверки: как узнать, будет ли проверка»

Увидеть себя глазами налоговиков и понять, что у компании низкая налоговая нагрузка, поможет сама ФНС. Для таких случаев служба выпустила Информацию «О расчете налоговой нагрузки с помощью специального калькулятора на сайте ФНС России».

О налоговом калькуляторе

В общем виде требования по на логовой нагрузке представлены в таблице ниже. Она составлена по типу «светофоров» в банк-клиенте (встроенная программа, «подсвечивающая» контрагентов разными цветами: зеленым, желтым, красным).

Таблица. «Светофор» налоговой нагрузки

Показатель

С чем сравнивать
(зеленый уровень)

Допустимое отклонение
(желтый уровень)

Опасное отклонение
(красный уровень)

Совокупная налоговая нагрузка, включая страховые взносы администрируемые налоговой Файл Среднеотраслевые показатели, характеризующие финансово-хозяйственную деятельность налогоплательщиков за 2018 год
Страница файла Excel «Нагрузка», графа 3 таблицы     5-7%      10%
Два вида рентабельности, в расчете которых участвует прибыль Страница файла Excel «Рентабельность», графы 3 и 4 таблицы      5-7%      10%
Различные показатели по НДС, наиболее важный из которых – вычеты На странице сайта nalog.ru задайте поиск отчета 1-НДС или найдите п. 5 подраздела «Отчеты о начислении и поступлении налогов, сборов и иных обязательных платежей» раздела «Отчеты, сформированные УФНС России по субъекту РФ» Отклонения не предусмотрены

Отметим, что, если фирма работает на УСН 15% (платит налог с разницы между доходом и расходами), применяет учетную политику, основанную на методе «по оплате» (т. е. регистрирует выручку в момент поступления оплаты и расходы – так же), то два вида рентабельности опосредованно влияют и на размер единого налога при этом спецрежиме.

Низкая налоговая нагрузка вполне объяснима, если компания только начала работать, даже если такая налоговая нагрузка ниже среднеотраслевой. Обычно достаточно предоставить в инспекцию пояснения, чтобы решить проблему.

Сложнее объяснить причины низкой налоговой нагрузки, когда компания работает не первый год. Ведь наиболее пристальное внимание у инспекторов вызывают именно причины снижения налоговой нагрузки.

Низкая налоговая нагрузка 

Налоговики не всегда знают, что компания осуществляет деятельность по нескольким ОКВЭД. Для расчета налоговой нагрузки они используют основной ОКВЭД. Однако данные при этом могут быть очень завышены.

В этом случае два варианта: 

  • сменить основной ОКВЭД и сообщить налоговикам, что и до этого работали по нему, так как законодательство не запрещает;
  • посчитать налоговую нагрузку по каждому виду своей деятельности.

До сих пор некоторые налоговые инспекции забывают включить в расчет налоговой нагрузки НДФЛ, поэтому всегда имеет смысл пересчитать все самостоятельно.

Подготовим налоговую стратегию для вашего бизнеса

Если все расчеты верны, то вновь образованная компания может объяснить низкую налоговую нагрузку в свои первые годы тем, что осуществляет:

  • не столько производственную, сколько инвестиционную деятельность;
  • развивает сеть продаж (производство).

Для уже работающей компании такое объяснение подойдет, если она также начала осваивать новый вид деятельности.

Аргументов, объясняющих возникновения убытков, очень много. Например, благодаря развитой в России системе статистики, можно указать налоговикам на упадок в конкретной отрасли и другие параметры, свидетельствующие об объективных причинах ухудшения дел в сфере, на которой специализируется компания или в которой работают ее основные покупатели.

Снижение налоговой нагрузки

Помимо инвестиций, в качестве причин снижения налоговой нагрузки можно указать другие объективные обстоятельства:

  • снижение объемов реализации;
  • повышение закупочных цен на сырье;
  • рост зарплаты, административных расходов и проч.

При этом данные «проблемного» года лучше предоставить в сравнении с прошлыми годами, где налоговая нагрузка была выше.

Составить универсальный образец текста пояснений невозможно. Все же мы постарались добавить в стандартный шаблон рекомендацию по формированию убедительного текста.

Скачать текст пояснения причин низкой налоговой нагрузки для ИФНС

Необходимо понимать, что, какие бы ни были уважительные причины, налоговики будут гнуть свою линию и требовать повысить налоговую нагрузку. Именно поэтому наши специалисты зачастую по вновь принятым на обслуживание клиентам берут огонь на себя и ходят на комиссии в налоговую по доверенности.

В дальнейшем мы переводим наших клиентов на режим «невидимки» – то есть работы с такими показателями по налоговой нагрузке, которые не заинтересуют налогового инспектора и не станут причиной «болезненного» интереса ИФНС к бизнесу клиента. Это единственный способ избежать и комиссий, и проверок, в том числе выездных.

Для того, чтобы компания не выбилась из нормативов по налоговой нагрузке, наши специалисты используют все самые актуальные наработки по созданию «режима невидимки». В процессе оказания бухгалтерских услуг мы не только обеспечиваем нашим клиентам такой режим, но и внимательно отслеживаем состояние показателя налоговой нагрузки.

В случае объективного снижения – готовим убедительные пояснения для ИФНС. Благодаря нашей заботе о клиентах, они могут спокойно развивать бизнес, без постоянного страха перед проверяющими с их обязательными многомиллионными доначислениями.

Заказать услугу

Хотите читать советы налоговых экспертов и главных бухгалтеров?

Подпишитесь на обновления блога

Подписаться

Поделиться статьей

Объяснительная записка - Ваше Право

Автор pravo На чтение 4 мин. Просмотров 39 Опубликовано

Перед нами документ, который служит для обоснования причины нарушений со стороны какого-либо работника. Написание происходит чаще всего в добровольной форме или после запроса руководителя, если действительно возникла какая-то вина: опоздание, не выход на работу, явление в нетрезвом состоянии, невыполнение поручения и так далее.

В качестве примеров можно привести следующее:

— о невыполнении должностных обязанностей
— о невыходе на работу
— о несвоевременном предоставлении документов
— об отсутствии на рабочем месте
— о невыполнении поручения
— о потере документов
— о неправильно пробитом чеке
— о невыполнении плана продаж
— по причине опоздания на работу

Скачать пустой бланк объяснительной записки .doc
Скачать образец заполнения объяснительной записки .doc

 

Для чего необходима записка

В основном нарушения, требующие пояснения от сотрудника считаются серьезными и приводят к взысканиям. Это чревато увольнением. Чтобы с этим не столкнуться и полностью разобраться, от грамотного руководителя поступает просьба с объяснением в письменном виде.

Таким образом, можно создать себе некую безопасность в конфликте. Это своего рода доказательство, документ для отправления при необходимости в судебную инстанцию.

 

Для кого пишется документ

В частых случаях составление идет на директора. Если же фирма крупная, тогда все пишется на руководство: начальнику, бригадиру и далее. Должность лица, на которое составляется записка, будет регулироваться по «Правилам внутреннего распорядка». Это присутствует в любой компании.

 

Когда пишется документ

Для написания имеются некоторые сроки: не более чем 2 рабочих дня с момента образования ситуации. По данной причине, когда руководитель оформляет требование с последующими объяснениями от работника, ставится дата – от нее ведется отчет. Если в этот промежуток она не написана, тогда можно применить определенное взыскание за проступок на законном основании.

Надо знать, что за единое нарушение применяется одно наказание и не позже, чем спустя месяц после установки факта при допущенном нарушении (факт указывают в письменном виде, составляя и регистрируя особый акт).

 

Как составляется записка

Она имеет свободный вид. Здесь надо вписать следующее:

  • данные о компании.
  • данные о руководителе и работнике, который виновен.
  • когда произошел проступок (дата).
  • пояснения.

От убедительности основной части зависит положение сотрудника. Среди аргументов надо выделить доводы, которые можно письменно обосновать: опоздание – медицинская справка, чек из сервиса ремонта авто с датой и временем, когда это происходило. С положительной стороны выступает раскаяние о нарушении (если оно действительно было) и обещание поправить ситуацию, больше не допуская подобного.

Если работник не признает вину, это тоже требуется указать и привести нужные доказательства при её отсутствии.

Написание доступно в ручной форме либо на компьютере. В первом варианте более удобно все составить. Опытные специалисты рекомендуют таким образом делать оформление. Но главное в этом деле – наличие реальной печати работника и соответствующая расшифровка.

Записка составляется в 2-х экземплярах. Первый отдают работодателю, второй оставляет себе сотрудник, как только на копиях будет поставлена отметка о получении объяснительных.

 

Как написать записку

Записка обладает вполне стандартной структурой по существующим нормам и правилам, и редко возникают какие-то трудности на этапе её составления.

Справа вверху в «шапке» вписывают данные об адресате.

  • Вначале пишут должность работника, на имя которого все было составлено: директор, начальник, руководитель отдела.
  • Указывается полное название компании и правовой статус: ИП, ОАО, ООО, ФИО адресата.
  • Аналогично оформляют информацию о сотруднике: должность, ФИО, название фирмы.
  • Пишется город, где прошла регистрация компании и дата составления записки.

В центральной части пишут название документа и суть вкратце (например, опоздание на работу).

Во 2-ой части идет основа. Сюда вписывают факты, причины проступка. Надо максимально точно указать пояснение, сформулировать аргументы. В случае письменного доказательства невиновности, это указывается. Не стоит писать очень много – никто не захочет читать большой текст. Подобное пояснение точно вызовет что-то отрицательное для работодателя.

Подписание заявления требует полной расшифровки подписи. Его передают секретарю или прямиком руководителю фирмы.

 

Как ответить на требования налоговиков по вычетам НДС?

Выбрать журналАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложенияАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложения: учет в сельском хозяйствеБухгалтер Крыма: учет в унитарных предприятияхБухгалтер Крыма: учет в сельском хозяйствеБухгалтер КрымаАптека: бухгалтерский учет и налогообложениеЖилищно-коммунальное хозяйство: бухгалтерский учет и налогообложениеНалог на прибыльНДС: проблемы и решенияОплата труда: бухгалтерский учет и налогообложениеСтроительство: акты и комментарии для бухгалтераСтроительство: бухгалтерский учет и налогообложениеТуристические и гостиничные услуги: бухгалтерский учет и налогообложениеУпрощенная система налогообложения: бухгалтерский учет и налогообложениеУслуги связи: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: бухгалтерский учет и налогообложениеАвтономные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераАвтономные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеБюджетные организации: акты и комментарии для бухгалтераБюджетные организации: бухгалтерский учет и налогообложениеКазенные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераКазенные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: акты и комментарии для бухгалтераОтдел кадров государственного (муниципального) учрежденияРазъяснения органов исполнительной власти по ведению финансово-хозяйственной деятельности в бюджетной сфереРевизии и проверки финансово-хозяйственной деятельности государственных (муниципальных) учрежденийРуководитель автономного учрежденияРуководитель бюджетной организацииСиловые министерства и ведомства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения здравоохранения: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения культуры и искусства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения образования: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения физической культуры и спорта: бухгалтерский учет и налогообложение

20192020

НомерЛюбой

Электронная версия

Пояснительная записка в ифнс по требованию образец — Назрановский аграрный техникум





Дело в том, что ИФНС проводит камеральную проверку всех полученных деклараций и бухгалтерской. Оформлению применяется ряд обязательных требований. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец по Раздел 8 Сведения из книги покупок налоговой декларации по. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец сегодня. Обычно в приложения выносят сведения о содержащихся в пояснительной записке таблицах, схемах, чертежах и графиках. В статье расскажем про образец пояснительной записки в налоговую по требованию, дадим инструкции по. Подскажите, правомерно ли требование работодателя написать объяснительную записку по причине отсутствия на. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в том случае, если инспекция потребует. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в том случае. Образец пояснительной записки налогового агента в ИФНС наименование организации адрес, телефон. Сопроводительное письмо в налоговую это пояснительная записка к уточненной. Если ифнс истребует пояснения, касающиеся низкой налоговой нагрузки в разрезе среднеотраслевого. Образец платежки по штрафу в ифнс в. Разумеется, объяснительная записка для ИФНС о причинах убытка. Пояснительная записка налогового агента в ИФНС образец заполнения чистый. Образец заявления в ИФНС на возврат ндфл бланк, форма 2015 года. Если ИФНС истребует пояснения, касающиеся. Бухгалтерская пояснительная записка для предъявления в налоговой подготавливается в случае уточненки по балансу или требованию. Итак, в письме этом сказано, что вы, такойто, будучи недалеким человеком, не проверили своих контрагентов и зачемто. В зависимости от сферы деятельности фирмы, в пояснительной записке раскрываются все. Эталон объяснительной записки налогового агента в ифнс. Образец расширенной пояснительной записки к балансу. И отразила в книжке покупок вычет по счетуфактуре от г. Янв 2017 Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пояснений см. Образец В ИФНС В пояснительной записке желательно указать нормы НК РФ предусматривающие эти. Как ответить на требование ифнс о том, что сумма дохода в декларации по налогу на. Работа ООО предприятий по системе УСНа может потребовать объяснительной на бюджет в налоговую. НДФЛ представление пояснений в ИФНС, образец пояснений. С февраля налоговики будут регистрировать только технику, которая передает сведения через Интернет в ИФНС. Пояснительная записка в налоговую по требованию, образец. В налоговую службу, можно ожидать уведомления с требованием пояснить сложившуюся ситуацию. Сен 2015 Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться. Иванову от ООО Рога и копыта ИНН. Это приблизительный текст пояснительной записки по убыткам. Руководителю ИФНС РФ по Советскому району г. Если организация обязана в обязательном порядке проводить аудиторскую проверку бухотчетности, но не подготовила пояснительной записки, в. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может выписками из налоговых и бухгалтерских регистров или иными документами п. В пояснительной записке должно сообщаться о фактах неприменения правил бухгалтерского учета в случаях, когда они не позволяют. Поскольку ошибки в налоговой декларации вами не выявлены, а статья 172 НК РФ не относит пояснительные записки. Пояснительная записка к налоговой декларации по налогу на добавленную стоимость при выявлении в ходе камеральной проверки. Уже несколько читателей сайта сообщили о том, что получили письма из налоговой инспекции с требованием. Срок на представление указанных пояснений 5 рабочих дней с момента получения требования п. Ниже расположен типовой бланк и образец пояснительной записки к. RПояснительная записка в ифнс по расхождению прибыли и ндс образец. Практике многие бухгалтерские работники испытывают сложности при написании пояснительной записки или вовсе игнорируют требование по ее представлению. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец для трех ситуаций в. В налоговой попросили меня написать пояснительную записку по камеральной Может. Иногда и в одном городе, у каждой ИФНС свои внутренние правила и форматы. Образец пояснения в ифнс по убыткам образец Как написать пояснение по убыткам пример. Как писать пояснения в налоговую по убыткам, образец, представленный ниже, нам поможет. Просит ифнс, попадаются такие, которые на 1ый взор не имеют никакого дела к налоговому. Подскажите в какой форме предоставляется пояснительная записка в ИФНС, при. В пояснительной записке должно сообщаться фактах неприменения правил бухгалтерского учета случаях. Подробнее об этом в материале те же налогоплательщики, у которых еще осталась. Как правильно написать пояснительную записку в налоговую по требованию образец. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в том случае, если инспекция потребует пояснений по какимлибо. Вам требование о представлении пояснений. Из ифнс пришло требование о предост. Пояснение в ИФНС по 6НДФЛ образец. Тогда довольно привести запись по. Пояснение в налоговую по 6ндфл эталон. Право не предоставлять пояснительную записку в составе бухгалтерской отчетности дано только малым. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец. Штрафные санкции именно за непредоставление пояснений по требованию не предусмотрены, но в. В пояснительной записке ИП Пономарев отметит. Объяснительная записка в ифнс образец. Попытаемся узнать, что же такое объяснительная записка в налоговую по требованию, и что. Указанные в Требовании, Заявитель считает Требование незаконным, а также полагает, что имеет. Пояснительная записка о причинах возмещения ндс образец. Право не предоставлять пояснительную записку в составе бухгалтерской отчетности дано малым. По договору возмездного Образец пояснительной записке по уточненному расчету в ифнс. О необходимости подачи пояснительной записки в налоговые. ПОЯСНЕНИЯ В ОТВЕТ НА СООБЩЕНИЯ ИФНС С ТРЕБОВАНИЕМ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ ПОЯСНЕНИЙ. Образец пояснительной записки налоговую требованию. ОГРН ИНН КПП Зарегистрировано в ИФНС России по г. Письмо с просьбой об отсрочке представления документов по требованию ИФНС. Эти пояснения надо представить в ИФНС в течение 5 рабочих дней со дня, следующего за днем получения вами от. Из налогвой прислали сообщение с требованием предоставления пояснений на расходжение между доходами от реализации. Статьи по запросу образец пояснительная записка в ифнс по требованию. Здравствуйте, пояснительная записка в произвольной форме, с указанием причин низкого уровня Сообщение от ИФНС с требованием дачи. Представленных ИФНС, печать налогового органа может. Пояснительная записка в ифнс по требованию образец проверенно KAV вирусов нет. Пояснительная записка к бухгалтерскому балансу образец 2016. Как составить пояснительную записку в налоговую инспекцию по зарплате. Какие причины убыточности назвать в пояснительной записке? Вправе затребовать ИФНС после камеральной проверки полученных данных в. Печатная форма Меню для документа Менютребование конфигурации БГУ 2. Этот раздел введен мною не по требованию законодательства, а. В наиблежайшее время хоть какой компании может придти требование из ифнс о. В пояснительной записке по убыткам должна содержаться. N89 автор вопроса 0 баллов. Настоящим сообщаем вам, что документы, указанные в Требовании о предоставлении документов. Затем пишем пояснительную записку в ДВУХ. Не всегда заполнения расчета проходит гладко. Разумеется, объяснительная записка для ИФНС о причинах убытка зависит от Пояснения

Подход может быть следующим набор показателей, отражаемых в пояснительной записке, должен. ИФНС наверняка захочет узнать, почему выручка и авансы в. Пояснительная записка в налоговую по требованию. В ИФНС висит образец в связи с арифметической ошибкой в декларации. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец 2 Руководителю ифнс России 12 по г. Чтото у нас не просили никаких пояснительных записок с требованием указания оборотов и состояния взаиморасчетов. Обращение в отделение Налоговой службы с пояснительными записками может обуславливаться получением. Как составить, согласно бухгалтерскому законодательству пояснительная записка является частью годового баланса. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в том. Год пояснительная записка по убыткам в ифнс образец. Образец пояснительной записки по низкой. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в том случае, если инспекция. В пояснительной тщательно описываются все происшествия, которые стали основанием для ухода в. Требование от организаций пояснений по убыткам явление в последнее время обычное. В ряде случаев налогоплательщикам требуется составлять пояснительные записки к документации по налоговой. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в. Помогите пожалуйста составить пояснительное письмо в налоговую! Направляем в Ваш адрес, согласно требованию о предоставлении документов от. Службы, в которое адресована записка. Пояснительная записка в ифнс по требованию образец. Приведем образец пояснительной записки. По всем полученным налоговым декларациям и расчетам ИФНС проводит камеральную проверку, в ходе. Обычно в приложения выносят сведения о содержащихся в пояснительной записке таблицах, схемах, чертежах и. Образец пояснительной записки к дипломной. Нк рф предприятие исчисляло налоговую базу по итогам налогового периода на основе. Пришла телефонограмма с требованием явиться в налоговую в связи с низкой налоговой нагрузкой. Не выгружается 760 форма пояснительной записки в ИФНС. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию может пригодиться вам в том случае, если инспекция потребует пояснений по. Также обоснованием может быть приказ руководителя, в котором указано требование снизить цену и. В пояснительной записке организация может указать, например По состояния на 31.Ответ на требование ИФНС о предоставлении пояснений по НДС 2017 инструкция. Образец пояснительной записки по требованию налоговой. Как выглядит образец пояснения в налоговую по 6НДФЛ. Образец ответа на требование налоговой о предоставлении пояснений. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец журнал. Образец объяснительной записки в налоговую. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец для трех ситуаций в нашей статье. Эталон объяснительной записки в налоговую по требованию может понадобиться вам в том случае, если инспекция. Образец пояснительной записки налогового агента в ИФНС. Образец пояснительной записки в налоговую по требованию. Пояснительная записка в налоговую по требованию образец и правила. Пояснения по поводу запроса налогового органа от по поводу низкого уровня заработной платы. Если ИФНС истребует пояснения, касающиеся низкой налоговой нагрузки в разрезе среднеотраслевого уровня. Ведь никто не застрахован от ошибок и от того, с какой ноги сегодня. Тема Пояснительная записка по встречной проверке.

Загрузить приложения к бухгалтерской отчетности

Загрузить приложения к бухгалтерской отчетности

К бухгалтерской (финансовой) отчетности можно приложить одну пояснительную записку и одно аудиторское заключение. Файл должен иметь расширение *.pdf.

В отчете перейдите в раздел «Пояснения» или «Аудит. заключение». Нажмите «Загрузить/С компьютера» и выберите документ. Файл может иметь расширение *.rtf, *.jpeg, *.tiff, *.png, *.doc, *.docx, *.xls, *.xlsx, *.txt, *.bmp. СБИС автоматически сконвертирует его в *.pdf.

Пояснительную записку можно заполнить в СБИС. Для этого в разделе «Пояснения» нажмите «Заполнить» и кликните . Внесите изменения и сохраните документ.

Кроме того, к бухгалтерской отчетности можно прикрепить внутренние документы. Например, скан-копии, дополнительные пояснения и расшифровки. Они не отправятся в налоговую, а сохранятся только в истории отчета. Перейдите в раздел «Документы» и нажмите «Загрузить».

Отправить приложения

Пояснительную записку можно отправить только вместе с бухгалтерской отчетностью, а аудиторское заключение как в составе отчета, так и отдельно.

Чтобы отправить аудиторское заключение после отправки бухгалтерской отчетности:

  1. В отчете перейдите в раздел «Аудит. заключение».
  2. Загрузите файл.
  3. Нажмите «Отправить».

В отчете нажмите «Прикрепить файл». Загрузите аудиторское заключение или пояснительную записку.

Отправить приложения

Пояснительную записку можно отправить только вместе с бухгалтерской отчетностью, а аудиторское заключение как в составе отчета, так и отдельно.

Чтобы отправить аудиторское заключение после отправки бухгалтерской отчетности:

  1. В отчете перейдите на вкладку «Прохождение». В блоке «Аудиторское заключение» нажмите «Отправить».
  2. Кликните «Добавить скан-образ», загрузите файл и нажмите «Готово».
  3. Аудиторское заключение появится в разделе «ФНС» на вкладке «Представления в ФНС». Отметьте его, передайте на подпись и отправьте в налоговую.

INTERFEROME v2.0: обновленная база данных аннотированных генов, регулируемых интерфероном | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interferome v2.0 (http://interferome.its.monash.edu.au/interferome/) представляет собой обновление более ранней версии базы данных Interferome, опубликованной в редакции базы данных NAR 2009 года. Значительно улучшенная вычислительная инфраструктура теперь позволяет выполнять более сложные и быстрые запросы и поддерживает больше наборов данных от клеток, мышей или людей, обработанных интерфероном (IFN) типов I, II и III.Количественные данные, соответствующие требованиям MIAME, собираются, подвергаются тщательному, стандартизированному, количественному и статистическому анализу, а затем загружаются значительные изменения в экспрессии генов. Комплексный ручной сбор метаданных в версии 2.0 обеспечивает гибкие возможности детального поиска, включая параметры: диапазон кратного изменения, тип IFN, концентрацию и время, а также тип клетки / ткани. Нет ограничений на количество генов, которые можно использовать для поиска в базе данных в одном запросе. Вторичный анализ, такой как онтология генов, регуляторные факторы, хромосомная локализация или графики тканевой экспрессии IFN-регулируемых генов (IRG), может быть выполнен в Interferome v2.0, либо данные могут быть загружены в удобных текстовых форматах, совместимых с распространенными программами вторичного анализа. Учитывая важность IFN для врожденных иммунных ответов при инфекционных, воспалительных заболеваниях и раке, это обновление интерферома до версии 2.0 облегчит идентификацию генных сигнатур, важных в патогенезе этих заболеваний.

ВВЕДЕНИЕ

Интерферон (IFN) был открыт и определен как белок, обладающий способностью защищать клетки от инфекции (1,2).Впоследствии выяснилось, что существует большое семейство белков IFN, которые обладают плейотрофными эффектами. Существует три типа IFN, а именно тип I (состоящий из подтипов α, β, κ, ε и ω), тип II (один IFNγ) и тип III (IFNλ; также называемый IL28 и IL29), которые различаются наличием различные генетические локусы, гомология аминокислотных последовательностей и специфические родственные рецепторы (3). Все IFN могут оказывать множество эффектов на клетки, включая способность модулировать рост, дифференцировку, пролиферацию, выживаемость / апоптоз и подвижность.В иммунной системе эти основные свойства приводят к способности IFN регулировать развитие и активность большинства эффекторных клеток (4,5). Они могут влиять на большинство клеток организма, которые экспрессируют родственные рецепторы, хотя и по-разному. Следовательно, они имеют широкий спектр воздействия на гомеостаз и патологию. IFN участвуют в ответе хозяина на инфекцию, воспаление, рак, аутоиммунитет и метаболические нарушения. Разнообразные свойства IFN привели к обширным исследованиям их терапевтического потенциала, и в настоящее время они используются для лечения хронических вирусных инфекций, некоторых видов рака и рассеянного склероза (6–8).Эффективность IFN варьируется более чем в 1000 раз. Поскольку IFN также могут вносить вклад в патогенез заболевания, проводятся клинические испытания реагентов, блокирующих активность IFN при таких заболеваниях, как системная красная волчанка (9). Введение IFN также имеет побочные эффекты, связанные с ограничивающей дозу токсичностью (10). Как следствие, существует значительный интерес к пониманию регуляции передачи сигналов IFN: как активируется или подавляется каждый путь передачи сигнала; какие биологические эффекты связаны с какими путями; и как их можно дифференцированно модулировать.

Как только IFN задействует свой родственный рецептор, активируется серия событий для передачи сигналов (11). Рецепторы IFN предварительно связаны с парами киназ JAK, которые после активации лигандом, связывающимся с его рецептором, фосфорилируют остатки тирозина друг на друге и на внутриклеточных доменах рецепторов. Это приводит к стыковке латентных цитоплазматических преобразователей сигнала и активаторов транскрипции (белков STAT) к активированному рецептору, фосфорилированию, а затем высвобождению из рецептора и транслокации в ядро, где они связываются с областями регулятора и активируют транскрипцию так так называемые IFN-регулируемые гены (IRG).Хотя определенные STAT исторически ассоциировались с определенными типами IFN [например, сигналы IFN типа I через связывание комплекса ISGF3 (STAT1: STAT2: IRF9) с элементами промотора ISRE, сигналы IFN типа II через связывание гомо- и гетеродимеров STAT1: STAT3 с элементами промотора GAS], диапазон сигналов, генерируемых лигированными рецепторами намного сложнее. Фактически, IFN могут активировать STAT 1, 2, 3, 4, 5 и 6 в зависимости от типа IFN и целевой ячейки (12). Кроме того, также активируются пути передачи сигналов, не относящиеся к STAT, включая киназу PI3, киназу MAP и другие (13).Активация этих многих путей передачи сигналов приводит к связыванию активированных факторов транскрипции с промоторами и регуляции экспрессии наборов IRG (14). Именно природа генов, их величина, продолжительность и клеточный контекст будут определять результат ответа IFN. Этот ответ будет варьироваться от клетки к клетке и может быть полезным или вредным для хозяина. IFN производятся при различных обстоятельствах (15). В последние годы произошла революция в понимании врожденной иммунной системы, которая эволюционировала, чтобы распознавать бактерии, вирусы и другие патогены, а затем вызывать немедленный ответ и формировать последующий, запомненный адаптивный иммунный ответ.Рецепторы распознавания образов клетки-хозяина могут ощущать молекулы патогенов и стимулировать выработку защитных цитокинов, таких как IFN. Многие исследования продемонстрировали решающую роль IFN в ответе на бактериальные и вирусные инфекции (16–18). Кроме того, эти пути эволюционировали, чтобы воспринимать молекулы патогенов, такие как нуклеиновые кислоты, и теперь признано, что они воспринимают и реагируют на ДНК и РНК, которые могут образовываться при различных физиологических и патологических обстоятельствах, тем самым определяя роль IFN в таких разнообразных заболеваниях, как аутоиммунитет. , рак, диабет, нейродегенерация и аномалии развития (19).Остается неясным, как IFN участвует в патогенезе этих заболеваний.

Существование геномных технологий, таких как микроматрицы, позволило провести полногеномную оценку изменений экспрессии генов при различных патофизиологических обстоятельствах. Генные сигнатуры все чаще используются при диагностике заболеваний, для анализа реакции на терапию, для стратификации пациентов, как средство понимания основы болезни и разработки новых терапевтических подходов. Учитывая важность ответа на IFN при многих заболеваниях и наше непонимание многих активированных сигнальных путей, мы приступили к проекту по сбору и аннотированию исчерпывающего списка регулируемых IFN генов, связанных данных и прогнозов путей и создали базу данных интерферомов. (www.interferome.org) (20). С момента публикации в 2009 году он получил более 2 миллионов просмотров, 48 цитирований в ведущих журналах, и мы получили много отзывов с просьбой о дополнительных функциях или доступе; см. статистику базы данных и (21). Здесь мы описываем обновление базы данных интерферома под названием v2.0 (http://interferome.its.monash.edu.au/interferome/).

Таким образом, вычислительная инфраструктура значительно улучшилась, что позволило поддерживать большее количество наборов данных, а также более быстрые и сложные запросы.Все данные соответствуют требованиям MIAME и подверглись количественному и статистическому анализу; данные количественные и подробно аннотированы. Исчерпывающие метаданные позволяют значительно улучшить гибкие возможности поиска. Нет ограничений на количество генов, которые могут быть запрошены одновременно. Расширенные аннотации позволяют более полную интерпретацию результатов, которые можно загрузить в удобных текстовых форматах для совместимости с обычными вторичными анализами.

СБОР, ОБРАБОТКА И АННОТАЦИЯ ДАННЫХ

Источники данных

Для включения в Интерфером v2.0, наборы данных микрочипов из экспериментов, в которых мышиные или человеческие клетки обрабатывали IFN, были собраны из он-лайн баз данных Arrayexpress и GEO. Данные были проверены на соответствие требованиям MIAME, а соответствующие публикации были изучены для проверки плана эксперимента и методологии, прежде чем данные были загружены для локального анализа.

Предварительная обработка данных

Для хранения, управления и статистического анализа экспериментов с микрочипами с различных платформ был установлен сервер BioArray Software Environment (BASE) (22).Эта обработка представляет собой значительное улучшение в Interferome v2.0 по сравнению с исходным Interferome («v1.0»), который включал только качественную повышающую или понижающую регулировку. Предварительная обработка данных массива зависела от платформы и конструкции массива. Необработанные данные из массивов Affimetrix были нормализованы с использованием метода Robust Multi-array Averaging (RMA) (23), который состоял из трех шагов: корректировка фона, квантильная нормализация (24) и суммирование (25). Для некоторых экспериментов были доступны только обработанные данные, и эти данные использовались только в том случае, если они были обработаны и нормализованы с использованием методов RMA, GeneChip RMA (GCRMA) или MicroArray Suite (MAS5).Данные с одноцветных матриц Agilent обрабатывались с использованием функций из пакета биопроводников Linear Models for Microarray (LIMMA) (LIMMA, http://bioinf.wehi.edu.au/limma). Неоднородные пятна были отфильтрованы из набора данных, и вычитание фона было выполнено с использованием функции Normexp со смещением 50. Нормализация до 75-го процентиля была выполнена для устранения технических различий между отдельными массивами. Данные из двухцветных массивов были нормализованы с применением normalizeWithinArrays и normalizeBetweenArrays (26,27).Данные от любых реплицированных зондов были усреднены, чтобы обеспечить единый показатель для каждого зонда в массиве. Все контрольные зонды Agilent были удалены. Нормализованные зонды с обеих платформ микрочипов были отфильтрованы для удаления признаков низкой интенсивности, которые были определены как зонды, которые не превышали 20-го процентиля по крайней мере в двух микроматрицах в течение всего эксперимента.

Проверка значимости

Ответы на интерферон были установлены путем сравнения экспрессии генов в обработанных интерфероном образцах с соответствующими контролями.Все данные были преобразованы в log2 перед анализом. Статистическая значимость любых различий в экспрессии генов проверялась с использованием парного или непарного t-критерия (28,29). Чтобы избежать любых предположений об одинаковой дисперсии, был принят t-критерий Велча; Предыдущий анализ показал, что t-критерий Велча был более консервативным и поэтому с меньшей вероятностью вернул ложные результаты, чем другие связанные тесты. Порог статистической значимости экспрессии генов был установлен на уровне P <0,05. Кратность изменения, вызванная обработкой интерфероном, была рассчитана для каждого значимого гена и представлена ​​в линейной шкале.

Аннотация к данным (метаданные)

Мощной конструктивной особенностью базы данных Interferome v2.0 является возможность поиска в наборах данных для изучения биологических факторов, влияющих на ответы IFN. Для этого вся информация, поставляемая с наборами данных и соответствующими публикациями, была тщательно изучена, чтобы извлечь экспериментальные метаданные для аннотации, которые будут использоваться позже, чтобы добавить ценную новую функцию, позволяющую выбирать конкретные экспериментальные функции при поиске в Interferome v2.0 база данных. Экспериментальные факторы включают тип и подтип IFN, время лечения и концентрацию, in vivo, (т.е. инъекция мыши или человека) или in vitro, (например, культура клеток), эксперимент, вид, (орган) система (например, гемопоэтическая, сердечно-сосудистая), орган, клетка, клеточная линия и нормальный / ненормальный и матричный дизайн. Концентрация дана в МЕ / мл, что является наиболее распространенной единицей, используемой в экспериментах, но следует отметить, что разные ИФН могут различаться в 1000 раз по своей удельной активности (МЕ / мг белка), поэтому эти единицы не означают эквимолярные концентрации; К важности концентрации следует относиться осторожно.«Аномальная» аннотация подразделяется на: генетический вариант (например, человек с известным генетическим заболеванием, трансгенная мышь или мышь с нокаутом гена), болезненное состояние (опять же, это может представлять человека с болезнью или модель болезни у мышей) и предварительная обработка. Пояснения ко всем этим параметрам можно найти на страницах «Помощь». Обратите внимание, что параметр по умолчанию для всех запросов к базе данных установлен на «Все», что означает, что каждый набор данных во всех категориях (все ткани, все IFN и т. Д.) Будет опрошен, если на странице поиска не выбраны конкретные экспериментальные факторы.Кроме того, страница поиска предоставляет пользователю возможность искать ответы генов на любую конкретную комбинацию экспериментальных факторов.

ВНЕДРЕНИЕ БАЗЫ ДАННЫХ

Release v2.0 Interferome DB использует объектно-ориентированный API на основе JAVA, поддерживающий реляционную базу данных MySQL. Исходный код Interferome и Java-API общедоступны и могут быть загружены с http://code.google.com/p/interferome/. База данных Interferome не зависит от операционной системы и доступна из любого стандартного веб-браузера или может быть установлена ​​локально с минимальным объемом оперативной памяти 3 ГБ для веб-сервера.Interferome v2.0 был разработан и протестирован со следующими версиями программного обеспечения: Java SE 1.6 × (http://www.oracle.com/technetwork/developer-tools/jdev/index.html), Tomcat6. × или выше (http: / /tomcat.apache.org/), Java Developing IDEA - IntelliJ 10. × или Eclipse 3.2. × (http://www.eclipse.org/), Apache Ant1.8 или более поздней версии (http: //www.apache. org /), Struts2. × или выше (http://struts.apache.org/2.x/), Spring 3.0 или выше (http://www.springsource.org/), Hibernate 2.5 или выше (http: //www.hibernate.org/), JQuery 1.4 (http: // jquery.com /), SVN 1.6 (http://subversion.apache.org/docs/release-notes/1.6.html) и MySQL5 или выше (http://www.mysql.com/).

ПОИСК В БАЗЕ

Для опроса базы данных ген мыши или человека или список генов могут быть представлены в одном из трех форматов: символ гена, регистрационный номер GenBank или список идентификаторов ансамблей. Количество представленных генов не ограничено, что является большим преимуществом по сравнению с исходной базой данных интерферома («v1.0»), которая была ограничена списком из 100 генов.

Если критерии поиска оставить в настройках по умолчанию, то будут запрошены все наборы данных в соответствии с приведенными выше описаниями. В качестве альтернативы можно выбрать для наборов данных, индуцированных определенным типом IFN, или подтипом в случае IFN типа I, концентрацию обработки (в МЕ / мл, а не в мкг или молярных концентрациях - см. Выше) и время лечения (Рисунок 1). Кроме того, в экспериментах было проведено только in vitro, в культурах клеток или, альтернативно, можно выбрать только инъекций in vivo, мышиной или человеческой системы.Тип образца может быть выбран из нормального (клетки или организм) или аномального (т. Е. Заболевание, генетическая изменчивость, в том числе нацеленный на ген или предварительная обработка). Последний выбор - это диапазон кратных изменений, которые пользователь хочет опросить. Могут быть выбраны гены с повышенной или пониженной регуляцией или гены, изменяющиеся в любом направлении. Значение по умолчанию для кратного изменения установлено как 2-кратное изменение, поскольку оно наиболее часто используется в литературе. Однако можно установить высокий порог (10 × или более), чтобы находить только гены с высокой степенью регуляции.В качестве альтернативы порог может быть установлен ниже (например, 1,5 ×), и в этом случае будет получен больший набор генов; это может быть преимуществом, если необходимо выполнить вторичный анализ, такой как анализ сайта связывания фактора транскрипции набора генов. Важно отметить, что база данных содержит все данные, которые считаются существенно отличающимися на уровне P <0,05; поэтому даже при настройках ниже 2-кратного будут выбираться только гены, экспрессия которых значительно изменена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПОИСКА

После того, как была выбрана команда «Поиск» (рис. 1):

  • Вкладка «Сводка генов » выберет страницу, на которой показаны детали исследуемого гена (Ensembl Id, имя гена, Описание, Entrez Номера GenBank и UniGene).

  • Вкладка « Experimental Data » представляет одну или несколько страниц результатов поиска , показывающих количество найденных записей данных. Они могут отображаться на страницах по 20–200 точек данных на странице, отсортированных по: -кратному изменению, типу IFN, времени лечения, Id (Ensembl или датчик набора данных), символу гена или набору данных. Данные, представленные на этой странице, могут быть упорядочены в соответствии с набором данных или в порядке возрастания или убывания кратного изменения. Данные представлены в таблице со следующими столбцами для:

    • Набор данных , который предоставляет ссылку на страницу, которая отображает исходный эксперимент с его уникальным идентификационным номером для внутреннего отслеживания интерферома; список наших вручную аннотированных экспериментальных факторов, которые включают метаданные, используемые для критериев поиска, и для которых «View Details» показывает исходную ссылку, Pubmed Id и ссылку на исходные данные в GEO или ArrayExpress.Этот раздел также включает подробный список экспериментальных результатов.

    • Изменение складки - это степень индукции или подавления гена.

    • Тип интерферона, время лечения (в часах), Символ гена и другие идентификаторы не требуют пояснений и имеют ссылки на Ensembl.

    • Идентификатор зонда добавлен для дополнительных деталей, потому что некоторые платформы массивов могут иметь несколько зондов для данного гена, и это иногда может давать разные результаты, например, если существуют разные транскрипты сплайсированного гена, которые по-разному регулируются IFN.

Данные можно загрузить в виде файла с разделителями табуляции или другого файла, который совместим с наиболее распространенными программами вторичного анализа.

ВТОРИЧНЫЙ АНАЛИЗ

В режиме «Поиск», помимо двух основных форматов представления данных, описанных выше, есть варианты для нескольких вторичных анализов (рис. 1), а именно:

  • Анализ онтологии - отображается в виде облака слов, в котором ген онтологии (GO), которые встречаются чаще, представлены более крупным шрифтом.Щелчок по термину GO в этом облаке ведет к соответствующей записи в базе данных GO [http://amigo.geneontology.org/; (30)]. Кроме того, данные представлены в табличном формате, содержащем столбцы для инвентарного номера GO, названия термина, определения и значения P для облегчения дальнейшего последующего анализа.

  • Анализ TF - представляет линейное представление 1500 пар оснований последовательности выше (5 ') от сайта начала транскрипции IRG, с цветными блоками, изображающими предсказанное связывание фактора транскрипции (TF) элементы в промоутере.Прогнозы основаны на алгоритме MATCH с использованием профессиональных матриц TRANSFAC 2012 с минимальным отсечением ложных срабатываний. Удерживание курсора мыши над каждым цветным блоком представляет подробную информацию о соответствующем факторе транскрипции. Если в критериях поиска выбраны «Все» данные или временные точки, то регулируемые гены могут представлять собой следствие как первичных, так и вторичных путей передачи сигнала IFN, регулирующих экспрессию генов. Если интерес представляют только IRG, на которые нацелены основные пути передачи сигналов IFN, рекомендуется ограничить поиск ранними временными точками, такими как 1 или, возможно, 3 часа.

  • IFN Subtype - отображает диаграмму Венна, показывающую, сколько генов регулируется каждым типом IFN, и перекрытие генов, регулируемых двумя или всеми тремя типами IFN. Следует отметить, что существует гораздо меньше наборов данных о генах, регулируемых IFN типа II или III, и это может внести систематическую ошибку или ложноотрицательные результаты в отношении генов, регулируемых этими подтипами. Таким образом, следует проявлять осторожность при интерпретации отрицательных результатов этого анализа.

  • Базальная экспрессия - отображает тепловую карту экспрессии IRG в их нестимулированном состоянии покоя в различных тканях и клетках. Данные по экспрессии у человека и мыши были получены из данных по тканям и клеточным линиям на портале BioGPS (31). Список IRG, полученный в результате поиска, наносится на график в зависимости от экспрессии в этих тканях и клетках, причем красный цвет указывает на высокую экспрессию, а синий - на низкую экспрессию.

Все результаты «Вторичного поиска» можно загрузить в виде файла с разделителями табуляции или другого файла.

БУДУЩИЕ НАПРАВЛЕНИЯ И НЕПРЕРЫВНОЕ ЛЕЧЕНИЕ

В последние годы доступность технологий геномики и усовершенствования аналитических методов, таких как те, что доступны в Интерфероме, высветили связь путей, активируемых интерфероном, в широком спектре заболеваний, включая вспышки гриппа (32), гепатит ( 33), ВИЧ (34), Mycobacterium tuberculosis (35), метастазы рака груди (36) и аутоиммунные нарушения (37). Аннотация этих путей открывает большие перспективы для разработки усовершенствованных диагностических средств и новых методов лечения и вакцин.Базы данных, такие как Interferome со связанными сайтами, вместе с использованием более сложных инструментов значительно облегчат идентификацию генов, связанных с заболеванием, и создание гипотез, которые будут проверены на доклинических моделях животных и клинических испытаниях.

Рисунок 1.

Скриншоты

Interferome v2.0 и рабочий процесс, изображающий домашнюю страницу (вверху) с опциями для выбора поиска IRG в наборе данных, статистикой базы данных, справкой, цитированием, контактной информацией, а также опцией отправки данных для включения в Интерфероме v2.0. При выборе «Поиск» открывается страница, на которой пользователь может выбрать различные параметры поиска или оставить вариант по умолчанию для поиска по всем наборам данных. Следующие страницы «Результаты поиска» показаны, как показано, с несколькими вариантами представления, и подробную информацию о данных можно найти, щелкнув набор данных, чтобы раскрыть подробности экспериментальных факторов, а после этого можно получить дополнительные экспериментальные данные, выбрав «Просмотр данных». вариант'. Несколько вариантов вторичного анализа в Interferome v2.0, а именно анализ фактора транскрипции (TF) (показан в соседнем поле), онтология, график хромосом, базальная экспрессия (тепловая карта тканевой экспрессии) или подтип IFN (диаграммы Венна, показывающие, сколько генов индуцируется каждым типом IFN).

Рисунок 1. Скриншоты

Interferome v2.0 и рабочий процесс, изображающий главную страницу (вверху) с опциями для выбора поиска IRG в наборе данных, статистикой базы данных, справкой, цитированием, контактной информацией, а также опцией отправки данных для включение в Интерфером v2.0. При выборе «Поиск» открывается страница, на которой пользователь может выбрать различные параметры поиска или оставить вариант по умолчанию для поиска по всем наборам данных. Следующие страницы «Результаты поиска» показаны, как показано, с несколькими вариантами представления, и подробную информацию о данных можно найти, щелкнув набор данных, чтобы раскрыть подробности экспериментальных факторов, а после этого можно получить дополнительные экспериментальные данные, выбрав «Просмотр данных». вариант'. Несколько вариантов вторичного анализа в Interferome v2.0, а именно анализ фактора транскрипции (TF) (показан в соседнем поле), онтология, график хромосом, базальная экспрессия (тепловая карта тканевой экспрессии) или подтип IFN (диаграммы Венна, показывающие, сколько генов индуцируется каждым типом IFN).

Команда Interferome v2.0 привержена постоянному контролю и совершенствованию базы данных. Основное направление деятельности - постоянное добавление новых данных. Пользователям рекомендуется отправлять данные для включения в Interferome v2.0 через новую вкладку « Submit data ».Мы просим, ​​чтобы данные были совместимы с MIAME и чтобы форма была загружена по ссылке (http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html), которая находится на веб-сайте. Это будет сопровождать загрузку файла данных, который будет рассмотрен администраторами БД Interferome перед статистическим анализом с использованием описанного выше конвейера. Гены и наборы данных, которые показывают значительную реакцию на лечение IFN, будут загружены в базу данных. Соответствующие подтверждающие экспериментальные данные должны быть доступны вместе с данными экспрессии генов, чтобы гарантировать, что все необходимые метаданные и экспериментальные факторы загружены в базу данных.

Кроме того, мы продолжим работу по улучшению и обновлению программ, используемых для вторичного анализа, и будем использовать их либо из общедоступной информации, либо из программ собственной разработки. В частности, мы будем изучать сайты связывания транскрипционных факторов (TFBS), пути и сетевые программы.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Австралийский национальный совет здравоохранения и медицинских исследований; Национальная служба данных Австралии; Центр передового опыта в области структурной и функциональной геномики микробов при Австралийском исследовательском совете; Парижский университет Декарта; и Программа поддержки оперативной инфраструктуры правительства Виктории.Финансирование платы за открытый доступ: Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям и Центр передового опыта в области структурной и функциональной микробной геномики Австралийского исследовательского совета.

Заявление о конфликте интересов. Не объявлено.

ССЫЛКИ

1,.

Вирусное вмешательство: часть I. Интерферон

,

Proc. R. Soc. Лондон. B Biol. Sci.

,

1957

, т.

147

(стр.

258

-

267

) 2,.

Иммунизирующий иммунитет против вирусов, инактивированных вакцинами против ультрафиолетовых лучей

,

C. R. Séances Soc. Биол. fil.

,

1954

, т.

148

(стр.

1700

-

1702

) 3,,.

Интерфероны, интерфероноподобные цитокины и их рецепторы

,

Иммунол. Ред.

,

2004

, т.

202

(стр.

8

-

32

) 4.

Обзор. Интерфероны I типа как праймеры, активаторы и ингибиторы врожденного и адаптивного иммунного ответа

,

Immunol.Cell Biol.

,

2012

, т.

90

(стр.

471

-

473

) 5,,,,,.

Прямое действие интерферонов I типа на клетки иммунной системы

,

Clin. Cancer Res.

,

2011

, т.

17

(стр.

2619

-

2627

) 6,,,,.

Интерферон-альфа для пациентов с хроническим гепатитом дельта: систематический обзор рандомизированных клинических исследований

,

Антивир. Ther.

,

2012

, т.

17

(стр.

1029

-

1037

) 7,,,,.

Индуцированные интерфероном-бета-1b краткосрочные и долгосрочные признаки лечебной активности при рассеянном склерозе

,

Pharmacogenomics J.

,

2012

8.

Иммунотерапия рака: опыт интерферона-альфа

,

Семин. Онкол.

,

2002

, т.

29

3 Доп. 7

(стр.

18

-

26

) 9,,.

Новые методы лечения системной красной волчанки с акцентом на нацеливание на интерферон-альфа

,

Clin.Иммунол.

,

2012

, т.

143

(стр.

210

-

221

) 10.

Интерферон I типа: друг или враг? Дж

,

Exp. Med.

,

2010

, т.

207

(стр.

2053

-

2063

) 11,,.

Рецепторы интерферона I типа: биохимия и биологические функции

,

J. Biol. Chem.

,

2007

, т.

282

(стр.

20053

-

20057

) 12,.

Путь JAK-STAT по адресу двадцать

,

Иммунитет

,

2012

, т.

36

(стр.

503

-

514

) 13.

Механизмы передачи сигналов, опосредованной интерфероном типа I и типа II

,

Nat. Rev. Immunol.

,

2005

, т.

5

(стр.

375

-

386

) 14,,,.

Идентификация генов, дифференциально регулируемых интерфероном альфа, бета или гамма, с использованием массивов олигонуклеотидов

,

Proc. Natl Acad. Sci. США

,

1998

, т.

95

(стр.

15623

-

15628

) 15,,.

Роль интерферонов типа I в ответах TLR

,

Immunol. Cell Biol.

,

2007

, т.

85

(стр.

446

-

457

) 16,,,,,,,,.

Нулевая мутация в гене, кодирующем компонент рецептора интерферона I типа, устраняет антипролиферативные и противовирусные ответы на интерфероны альфа и бета и изменяет ответы макрофагов

,

Proc. Natl Acad. Sci. США

,

1995

, т.

92

(стр.

11284

-

11288

) 17,,,,,,.

Функциональная роль интерферонов типа I и типа II в противовирусной защите

,

Science

,

1994

, vol.

264

(стр.

1918

-

1921

) 18,,.

Паттерны патогенеза: различение патогенных и непатогенных микробов по врожденной иммунной системе

,

Cell Host Microbe

,

2009

, vol.

6

(стр.

10

-

21

) 19,.

Рецепторы распознавания образов и воспаление

,

Cell

,

2010

, т.

140

(стр.

805

-

820

) 20,,,.

ИНТЕРФЕРОМ: база данных генов, регулируемых интерфероном

,

Nucleic Acids Res.

,

2009

, т.

37

(стр.

D852

-

D857

) 21,,.

Системная биология интерфероновых ответов

,

J. Interferon Cytokine Res.

,

2011

, т.

31

(стр.

5

-

11

) 22,,,.

BASE – программное обеспечение 2-го поколения для управления и анализа данных микрочипов

,

BMC Bioinformatics

,

2009

, vol.

10

стр.

330

23,,,,,,.

Исследование, нормализация и обобщение данных уровня зондов с массивом олигонуклеотидов высокой плотности

,

Biostatistics

,

2003

, vol.

4

(стр.

249

-

264

) 24,,,.

Сравнение методов нормализации данных массива олигонуклеотидов высокой плотности на основе дисперсии и систематической ошибки

,

Bioinformatics

,

2003

, vol.

19

(стр.

185

-

193

) 25,,,,,.

Сводка данных об уровне зондов Affymetrix GeneChip

,

Nucleic Acids Res.

,

2003

, т.

31

стр.

e15

26,,.

Использование репликативных пятен внутри массива для оценки дифференциальной экспрессии в экспериментах с микрочипами

,

Bioinformatics

,

2005

, vol.

21

(стр.

2067

-

2075

) 27,.

Нормализация данных микрочипов кДНК

,

Методы

,

2003

, т.

31

(стр.

265

-

273

) 28.

Сравнительный обзор статистических методов обнаружения дифференциально экспрессируемых генов в реплицированных экспериментах с микрочипами

,

Bioinformatics

,

2002

, vol.

18

(стр.

546

-

554

) 29,,,.

Статистические методы идентификации дифференциально экспрессируемых генов в экспериментах с реплицированными микрочипами кДНК

,

Stat Sin

,

2002

, vol.

12

(стр.

111

-

139

) 30,,,,,,,,, и др.

Генная онтология: инструмент для объединения биологии. Консорциум генных онтологий

,

Nat. Genet.

,

2000

, т.

25

(стр.

25

-

29

) 31,,,,,,,,, и др.

BioGPS: расширяемый и настраиваемый портал для запросов и организации ресурсов аннотации генов

,

Genome Biol.

,

2009

, т.

10

стр.

R130

32,,,.

У беременных ослаблена врожденная реакция интерферона на вирус пандемического гриппа A 2009 г. подтипа h2N1

,

J. Infect. Дис.

,

2012

, т.

206

(стр.

646

-

653

) 33,,,,,,,,, и др.

IL28B связан с ответом на терапию интерфероном-альфа и рибавирином при хроническом гепатите C

,

Nat. Genet.

,

2009

, т.

41

(стр.

U1100

-

U1174

) 34,,,,,,,,, и др.

ВИЧ-инфекция дендритных клеток нарушает путь индукции IFN через IRF-1 и подавляет продукцию IFN 1 типа

,

Blood

,

2011

, vol.

118

(стр.

298

-

308

) 35,,,,,,,,, и др.

Интерферон-индуцируемая нейтрофильная сигнатура транскрипции крови при туберкулезе человека

,

Nature

,

2010

, vol.

466

(стр.

973

-

977

) 36,,,,,,,,, и др.

Подавление путей Irf7 в клетках рака молочной железы способствует метастазированию в кости за счет ускользания иммунной системы

,

Nat. Мед

,

2012

37,,,,,,.

Анализ кумулятивных изменений в щитовидной железе при болезни Грейвса указывает на то, что сигнатура IFN, плазмацитоидные DC и альтернативно активированные макрофаги являются факторами, определяющими хронологию

,

J. Autoimmun.

,

2011

, т.

36

(стр.

189

-

200

)

Заметки автора

© Автор (ы) 2012. Опубликовано Oxford University Press.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), которая разрешает некоммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение в любых средний при условии правильного цитирования оригинала. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь в журналы[email protected]

(PDF) IFNs типа I и III, продуцируемые плазматическими дендритными клетками в ответ на член Flaviviridae, подавляют клеточные иммунные ответы

22. Котенко С.В., Г. Галлахер, В.В. Баурин, А. Льюис-Антес, М. Шен. ,

NK Shah, JA Langer, F. Sheikh, H. Dickensheets и RP Donnelly. 2003.

IFN-lambdas опосредуют противовирусную защиту через отдельный рецепторный комплекс цитокина

класса II. Nat.Иммунол. 4: 69–77.

23. Шеппард П., В. Киндсфогель, В. Сюй, К. Хендерсон, С. Шлюцмайер,

Т. Э. Уитмор, Р. Куэстнер, У. Гарригес, К. Биркс, Дж. Рорабак и др. 2003. IL-

,

28, IL-29 и их рецептор цитокинов класса II IL-28R. Nat. Иммунол. 4: 63–68.

24. Ши, X., Y. Pan, M. Wang, D. Wang, W. Li, T. Jiang, P. Zhang, X. Chi, Y. Jiang,

Y. Gao, et al. 2012. Генетическая изменчивость IL28B связана со спонтанным клиренсом

вируса гепатита C, ответом на лечение, уровнями IL-28B в сыворотке в китайской популяции

nese.PLoS One 7: e37054 doi: 10.1371 / journal.pone.0037054.

25. Zhang, L., N. Jilg, R. X. Shao, W. Lin, D. N. Fusco, H. Zhao, K. Goto,

L. F. Peng, W. C. Chen и R. T. Chung. 2011. IL28B подавляет репликацию вируса гепатита C

через путь JAK-STAT. J. Hepatol. 55: 289–298.

26. Джилг, Н., В. Линь, Дж. Хонг, Э. А. Шефер, Д. Вольски, Дж. Мейксонг, К. Гото,

К. Брисак, П. Чусри, Д. Н. Фуско и др. 2014. Кинетические различия в индукции

интерферон-стимулированных генов интерфероном-альфа и IL28B изменяются в результате инфицирования

вирусом гепатита С.Гепатология 59: 1250–1261.

27. Кугель Д., Дж. Э. Пульверер, М. Костер, Х. Хаузер и П. Стахели. 2011. Novel

невирусных биоанализов на интерферон мышей типа I и типа III. J. Интерферон цито-

кин. Res. 31: 345–349.

28. Рид, Э., Н. Джулефф, С. Габбинс, Х. Прентис, Дж. Сиго и Б. Чарльстон. 2011.

Дендритные клетки плазмацитоидных клеток крупного рогатого скота являются основным источником интерферона I типа в ре-

вирусе ящура in vitro и in vivo.J. V irol. 85: 4297–4308.

29. Джулефф, Н., М. Виндзор, Э. А. Лефевр, С. Губбинс, П. Хамблин, Э. Рид, К. Маклафлин,

П. К. Беверли, И. У. Моррисон и Б. Чарльстон. 2009. Вирус ящура

может вызывать специфическую и быструю независимую от CD4 + Т-клеток нейтрализацию и иммунный ответ с переключаемым классом изотипа

у крупного рогатого скота

¨

ve. J. Virol. 83: 3626–3636.

30. Мейерс, Г., А. Эге, К. Фетцер, М. фон Фрейбург, К.Элберс, В. Карр, Х. Прентис,

Б. Шарлестон и Э. М. Ш.

urmann. 2007. Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота: до

предотвращение стойкой внутриутробной инфекции за счет комбинации двух мутаций, влияющих на

РНКазу Эрнса и протеазу Npro. J. Virol. 81: 3327–3338.

31. МакШейн, Х., С. Бехбуди, Н. Гунетиллеке, Р. Брукс и А. В. С. Хилл. 2002.

Защитный иммунитет против Mycobacterium tuberculosis, индуцированный дендритными клетками

, пульсирующими CD8 (+) - и CD4 (+) - Т-клеточными эпитопами антигена 85A.

Заражение. Иммун. 70: 1623–1626.

32. Фрей М. Д., Г. Э. Манн и Б. Чарльстон. 2001. Валидация анализа репортерного гена Mx / CAT

для количественного определения бычьего интерферона I типа. J. Immunol.

Методы 249: 235–244.

33. Байджент, С. Дж., Дж. Чжан, М. Д. Фрей, Х. Флик-Смит, С. Гудборн, и

Дж. У. МакКоли. 2002. Ингибирование транскрипции бета-интерферона не-

цитопатогенным вирусом бычьей вирусной диареи осуществляется посредством механизма, регулирующего интерферон

, зависимого от фактора 3.J. Virol. 76: 8979–8988.

34. Корапи В. В., Р. О. Донис и Э. Дж. Дубови. 1990. Характеристика панели

моноклональных антител и их использование в изучении антигенного разнообразия вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

. Являюсь. J. Vet. Res. 51: 1388–1394.

35. Депнер К., Т. Бауэр и Б. Лисс. 1992. Термическая и pH-стабильность пестицидов

рус. Ред. - Выкл. Int. Эпизоот. 11: 885–893.

36. Guzylack-Piriou, L., C. Balmelli, K.К. Маккалоу и А. Саммерфилд. 2004.

CpG-олигонуклеотиды типа A активируют исключительно свиные природные клетки, продуцирующие интерферон-

, для секреции интерферона-альфа, фактора некроза опухоли-альфа и

интерлейкина-12. Иммунология 112: 28–37.

37. Круг, А., С. Ротенфуссер, В. Хорнунг, Б. Ярсдо

¨

rfer, S. Blackwell,

З. К. Баллас, С. Эндрес, А. М. Криг и Г. Хартманн. 2001. Идентификация

олигонуклеотидных последовательностей CpG с высокой индукцией IFN-альфа / бета в плазме

мацитоидных дендритных клеток.Евро. J. Immunol.

31: 2154–2163.

38. Ruedl, C., C. Rieser, G. Bo

¨

ck, G. Wick и H. Wolf. 1996. Фенотипическая и

функциональная характеристика популяции дендритных клеток CD11c + у мышей Pey-

er’s бляшек. Евро. J. Immunol. 26: 1801–1806.

39. Робинсон, Л., М. Виндзор, К. Маклафлин, Дж. Хоуп, Т. Джексон, и

Б. Чарлстон. 2011. Вирус ящура проявляет измененный тропизм в

присутствии специфических иммуноглобулинов, вызывающих продуктивную инфекцию и

уничтожающих дендритные клетки.J. Virol. 85: 2212–2223.

40. Инаба, К., У. Дж. Свиггард, Р. М. Штейнман, Н. Романи, Г. Шулер и К. Бринстер.

2009. Выделение дендритных клеток. Curr. Prot. Иммунол. Глава 3: Блок 3 7.

41. Дочеул В., Б. Чарлстон, Х. Крук, Э. Рид, П. П. Пауэлл и Дж. Сиго. 2008.

Продукт Npro вируса классической чумы свиней взаимодействует с IkappaBalpha, ингибитором

NF-kappaB. J. Gen. Virol. 89: 1881–1889.

42. Мейер, К., М.Фон Фрейбург, К. Эльберс и Г. Мейерс. 2002. Выделение

вирулентных и ослабленных по РНКазе аттенуированных вирусов бычьей вирусной диареи 2 типа из

инфекционных клонов кДНК. J. Virol. 76: 8494–8503.

43. фон Фрейбург, М., А. Эге, А. Заальм

Уллер и Г. Мейерс. 2004. Сравнение

эффектов РНКаза-отрицательного вируса и вируса классической чумы свиней дикого типа на pe-

риферических клетках крови инфицированных свиней. J. Gen. Virol. 85: 1899–1908.

44. Деллгрен К., Х. Х. Гад, О. Дж. Хэмминг, Дж. Мельхьорсен и Р. Хартманн. 2009.

Человеческий интерферон-лямбда3 является мощным членом семейства интерферонов III типа.

Genes Immun. 10: 125–131.

45. Бракенбери, Л. С., Б. В. Карр, З. Стаматаки, Х. Прентис, Э. А. Лефевр,

К. Дж. Ховард и Б. Чарльстон. 2005. Идентификация клеточной популяции

, продуцирующей альфа / бета-интерферон in vitro и in vivo в ответ на нецитопатический вирус вирусной диареи крупного рогатого скота

.J. Virol. 79: 7738–7744.

46. Концек П., Борецки Л.

´

и М. Нова

´

к. 1991. Идентичны ли кислотолабильный интерферон

альфа и интерферон омега-1? Вирусология 181: 416–418.

47. Джуэлл, Н. А., Т. Клайн, С. Э. Мерц, С. В. Смирнов, Э. Флан

~

o, К. Шиндлер,

Дж. Л. Гривс, Р. К. Дурбин, С. В. Котенко и Дж. Э. Дурбин. 2010. Лямбда

интерферон является преобладающим интерфероном, индуцируемым вирусом гриппа A

in vivo.J. Virol. 84: 11515–11522.

48. Mordstein, M., E. Neugebauer, V. Ditt, B. Jessen, T. Rieger, V. Falcone,

F. Sorgeloos, S. Ehl, D. Mayer, G. Kochs, et al. 2010. Лямбда-интерферон делает

эпителиальных клеток респираторного и желудочно-кишечного тракта устойчивыми к вирусным

инфекциям. J. Virol. 84: 5670–5677.

49. Потт, Дж., Т. Махлаков, М. Мордштейн, К. У. Дюрр, С. Стокингер, П. Стахели и

М. Хорнеф. 2011. Критическая роль интерферонов III типа при ротавирусной инфекции.

Внутр. J. Med. Microbiol. 301: 43.

50. Анк, Н., М.Б. Иверсен, К. Бартольди, П. Стахели, Р. Хартманн, У. Б. Йенсен,

Ф. Дагнес-Хансен, А. Р. Томсен, З. Чен, Х. Хауген, и другие. 2008. Важная роль интерферона III типа (IFN-lambda / IL-28) в TLR-индуцированной противовирусной активности

. J. Immunol. 180: 2474–2485.

51. Саган, С. М., и П. Сарнов. 2010. Плазмацитоидные дендритные клетки как хранители в печени, инфицированной вирусом гепатита С

.Proc. Natl. Акад. Sci. США 107: 7625–7626.

52. Такахаши К., С. Асабе, С. Виланд, У. Гараигорта, П. Гастаминза, М. Исогава,

и Ф. В. Чисари. 2010. Плазмацитоидные дендритные клетки обнаруживают вирус гепатита С -

инфицированных клеток, продуцируют интерферон и подавляют инфекцию. Proc. Natl. Акад. Sci.

США 107: 7431–7436.

53. Питон, С., М. Гербер, Р. Сутер, Н. Ругли и А. Саммерфилд. 2013. Эффективное зондирование

инфицированных клеток в отсутствие вирусных частиц плазматическими дендритными клетками

блокируется вирусной рибонуклеазой E (rns.). PLoS Pathog. 9: e1003412 doi:

10.1371 / journal.ppat.1003412.

54. Макрей, Б. Л., Т. Нагаи, Р. Т. Семнани, Дж. М. ван Севентер и Г. А. ван

Seventer. 2000. Интерферон-альфа и -бета ингибируют in vitro дифференцировку иммунокомпетентных дендритных клеток человека

из предшественников CD14 (+). Кровь 96: 210–217.

55. Радвани, Л. Г., А. Банерджи, М. Вейр и Х. Месснер. 1999. Низкие уровни интерферона-альфа

индуцируют экспрессию CD86 (B7.2) и ускоряют созревание дендритных клеток

из мононуклеарных клеток периферической крови человека.Сканд. J. Immunol.

50: 499–509.

56. Виземанн, Э., Д. Со

¨

nmez, F. Heidenreich и A. Windhagen. 2002. Интерферон-

,

,

,

ta увеличивает стимулирующую способность дендритных клеток, происходящих из моноцитов, по отношению к IL-13, IL-5 и IL-10 в аутологичных Т-клетках. J. Neuroimmunol. 123: 160–169.

57. Пакетт, Р. Л., Н. К. Хсу, С. М. Кирчер, А. Н. Парк, М. Д. Рот, и

Дж. А. Гласпи. 1998. Интерферон-альфа и колония гранулоцитов / макрофагов -

Стимулирующий фактор

дифференцируют моноциты периферической крови в мощные антигенпрезентирующие клетки

.J. Leukoc. Биол. 64: 358–367.

58. Сантини, С. М., К. Лапента, М. Логоцци, С. Парлато, М. Спада, Т. Ди Пуккио и

Ф. Беларделли. 2000. Вмешательство типа I в качестве мощного адъюванта для развития и активности дендритных клеток, происходящих из моноцитов

, in vitro и у мышей Hu-PBL-SCID

. J. Exp. Med. 191: 1777–1788.

59. Ито Т., Р. Амакава, М. Инаба, С. Икехара, Ф. Инаба и С. Фукухара. 2001.

Дифференциальная регуляция субпопуляций дендритных клеток крови человека с помощью IFN.J.

Immunol. 166: 2961–2969.

60. Люфт Т., П. Лютенс, Х. Хохрайн, Т. Той, К. А. Мастерман, М. Ризкалла,

К. Малишевски, К. Шотмэн, Дж. Себон и Э. Марасковский. 2002. IFN-альфа

усиливает опосредованную лигандом CD40 активацию незрелых дендритных клеток

, происходящих из моноцитов. Int. Иммунол. 14: 367–380.

61. Чи Б., Х. Л. Диккеншитс, К. М. Спанн, М. А. Олстон, К. Луонго,

Л. Дюмутье, Дж. Хуанг, Дж. К. Рено, С. В.Котенко, М. Родерер и др. 2006.

Альфа- и лямбда-интерферон вместе опосредуют подавление CD4 T-клеток в-

, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом. J. Virol. 80: 5032–5040.

62. Бартоломе

×

, Э. Дж., Ф. Виллемс, А. Крузо, К. Тилеманс, Л. Шанден и

М. Гольдман. 1999. IFN-бета препятствует дифференцировке дендритных клеток

от мононуклеарных клеток периферической крови: селективное ингибирование CD40-

-зависимой секреции интерлейкина-12.J. Interferon Cytokine Res. 19: 471–478.

63. Сопп П., Л. Б. Хупер, М. К. Кларк, К. Дж. Ховард и Дж. Браунли. 1994.

Обнаружение белка p80 вируса диареи крупного рогатого скота в субпопуляциях лейкоцитов крупного рогатого скота

. J. Gen. Virol. 75: 1189–1194.

64. Mennechet, F. J. D., and G. Uze

´

. 2006. Обработанные интерфероном лямбда дендритные клетки

специфически индуцируют пролиферацию супрессорных Т-клеток, экспрессирующих FOXP3. Кровь

107: 4417–4423.

65. Pritchard, A. L., M. L. Carroll, J. G. Burel, O. J. White, S. Phipps, and

J. W. Upham. 2012. Врожденные IFN и плазматические дендритные клетки ограничивают ответы цитокинов Th3

на риновирус: регуляторный механизм, имеющий отношение к астме

. J. Immunol. 188: 5898–5905.

66. Дауэр М., К. Бауэр, Ф. Бауэрнфейнд, М. Шнурр, С. Эндрес, В. Хельдвайн и

А. Эйглер. 2006. Комбинация вакцины на основе дендритных клеток с гемцитабином на модели

мышиной карциномы поджелудочной железы.Med. Клин. 110: 38–47.

67. Джордан, У. Дж., Дж. Эскдейл, М. Бониот, М. Родиа, Д. Келлнер и Г. Галлахер.

2007. Модуляция цитокинового ответа человека интерфероном лямбда-1 (IFN-

lambda1 / IL-29). Genes Immun. 8: 13–20.

68. Srinivas, S., J. Dai, J. Eskdale, G.E. Gallagher, N. J. Megjugorac, and

G. Gallagher. 2008. Интерферон-лямбда1 (интерлейкин-29) преимущественно понижает

, регулирует интерлейкин-13 по сравнению с другими цитокиновыми ответами Т-хелперов типа 2 in vitro.

Иммунология 125: 492–502.

69. Зиблер, Дж., С. Вирц, Б. Вейгманн, И. Атрейя, Э. Шмитт, А. Крефт, П. Р. Галле,

и М. Ф. Нейрат. 2007. IL-28A является ключевым регулятором опосредованного Т-клетками поражения печени

через фактор транскрипции T-box T-bet. Гастроэнтерология 132: 358–371.

70. Виндзор, М.А., Б.В. Карр, Б. Банковски, Д. Гибсон, Э. Рид, П. Хамблин,

С. Габбинс, Н. Джулефф и Б. Чарльстон. 2011. У крупного рогатого скота остается иммунокомпетент-

во время острой фазы заражения вирусом ящура.Вет.

Рез. 42: 108.

71. Ховард, К. Дж., М. К. Кларк, П. Сопп и Дж. Браунли. 1992. Иммунитет к вирусу диареи крупного рогатого скота

, вирус диареи телят: роль различных субпопуляций Т-клеток ана-

, лизированных специфическим истощением in vivo моноклональными антителами. Вет. Иммунол.

Immunopathol. 32: 303–314.

4226 ИММУНОСУПРЕССИЯ ТИПА I И III, ИНДУЦИРОВАННАЯ ИФН

в Институте Пирбрайта, 24 мая 2016 г. жир у пациентов с ожирением и неалкогольной жировой болезнью печени | Journal of Translational Medicine

Пациенты

Мы провели обсервационное исследование поперечного сечения, в котором в определенный момент времени мы описали характеристики пациентов с ожирением без последующего наблюдения с основными переменными, т. Е.е., уровни IFN и оценки IMTG по сравнению с контролем.

В частности, в этом дополнительном исследовании использовалась та же исходная выборка пациентов, что и в предыдущем исследовании [16], но с совершенно другими аналитическими подходами, в результате чего они были одинаково достоверными, согласно Международному комитету редакторов медицинских журналов (ICMJE) по адресу http: //www.icmje.org/recommendations/browse/publishing-and-editorial-issues/overlapping-publications.html.

В этом исследовании были отобраны 80 пациентов, которые соответствовали критериям включения и ранее давали устный или, по возможности, письменный консенсус, сравнивая их с 38 здоровыми субъектами (контрольная группа).

Критерии включения

Пациенты с ожирением и разной степенью ожирения, соблюдающие низкокалорийную диету с низким содержанием жиров и малоподвижный образ жизни, с низкой распространенностью сопутствующих заболеваний, таких как сахарный диабет 2 типа и артериальная гипертензия, но NALFD, документально подтвержденная в США.

Критерии исключения

Пациенты были исключены, если на момент взятия пробы крови они сами сообщили о настоящем или предшествующем (в прошлом месяце) гриппе, простудном статусе и гастроэнтерите или если в анамнезе была необъяснимая потеря веса месяцев (т.е., ± 10% от начальной массы тела) или недавнее заболевание / хроническое заболевание, а также использование добавок или лекарств, которые могли повлиять на состав тела или метаболизм мышц (например, стероиды). Саркопеническое ожирение было исключено из этой выборки.

Кроме того, любое вирусное, аутоиммунное, метаболическое заболевание печени (болезнь Вильсона, гемохроматоз или недостаточность антитрипсина) было исключено с помощью соответствующих тестов в соответствии с общепринятыми диагностическими рекомендациями. Глютеновая болезнь была исключена путем оценки антител IgA к тканевой трансглутаминазе.Злоупотребление алкоголем было запрещено в соответствии с диагностическими критериями DSM-IV с помощью скрининговых тестов, таких как MAST (Мичиганский тест на выявление алкоголя) и CAGE (сокращение, раздражение, виновность и вскрытие глаз), а также случайных тестов на содержание алкоголя в крови. концентрация и использование суррогатного маркера, например, среднего корпускулярного объема. Пациенты, принимавшие гипотензивные препараты, а также пациенты, получавшие метформин или инсулин, поддерживали сбалансированный терапевтический режим на протяжении всего исследования.

Антропометрическая оценка

Три степени ожирения (легкая, умеренная и тяжелая или 1-2–3) были установлены на основе пороговых значений ИМТ 30–34.9 и 35–39,9 и> 40 кг / м 2 соответственно.

Висцеральное ожирение было идентифицировано путем измерения WC в средней точке между нижней границей грудной клетки и гребнем подвздошной кости. Окружность бедра измерялась вокруг самой широкой части ягодиц, при этом лента параллельна полу, а соотношение талии и бедер (WHR) рассчитывалось в соответствии с данными Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек, согласно которым женщины с WHR более 0,8, а мужчины - более 1.0 подвергаются повышенному риску для здоровья из-за распределения жира.

Метаболический профиль

Каноническая панель лечения взрослых III была первоначально выбрана для определения метаболического синдрома с учетом как минимум трех критериев: концентрация глюкозы в плазме ≥ 100 мг дл -1 , WC> 102/88 см (мужчины / женщины) , сывороточная концентрация ЛПВП <50 мг дл -1 для женщин и <40 мг дл -1 для мужчин, артериальное давление ≥ 130/85 мм рт.ст. и концентрация триглицеридов в сыворотке ≥ 150 мг дл -1 .Но, чтобы придерживаться этнических ценностей, мы добавили критерии метаболического синдрома для европеоидов в соответствии с Международной классификацией диабета (IDF), то есть в соответствии с определением IDF для пациента, который должен быть определен как имеющий метаболический синдром, у него должно быть определено центральное ожирение. как WC со значениями, специфичными для этнической принадлежности, например, для мужчин и женщин в Европе, равными или превышающими 94 и 80 см, соответственно), плюс любые два из следующих четырех факторов: триглицериды> 150 мг / дл или специфическое лечение этой липидной аномалии; холестерин ЛПВП <50 мг / дл для женщин и 40 мг / дл для мужчин или специальное лечение этой дислипидемии; систолическое и диастолическое артериальное давление равное или выше 130 и 85 мм рт. ст. соответственно; уровень глюкозы в плазме натощак> 100 мг / мл или ранее диагностированный сахарный диабет 2 типа.Международная федерация диабета, 2007 г .; http://www.idf.org.

Значения триглицеридов у субъектов, голодавших по крайней мере 12/14 ч до взятия крови, оценивали, усредняя результаты по крайней мере двух определений, сделанных в разные дни.

Лабораторная оценка

Уровни IFN у 78 пациентов, полученные с помощью ранее изученной панели 48 цитокинов / хемокинов [16], которая была выполнена на образцах сыворотки с использованием мультиплексных иммуноанализов на основе магнитных шариков (Bio-Plex) (BIO-RAD Laboratories , Милан, Италия) в соответствии с инструкциями производителя.Данные реакций были получены с использованием считывающего устройства Bio-Plex 200, в то время как цифровой процессор управлял выводом данных, а программное обеспечение Bio-Plex Manager возвращало данные в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) и концентрации (пг / мл). Инсулинорезистентность изучали методом HOmeostatic Metabolic Assessment (HOMA) по формуле: инсулин натощак (мкЕд / мл) × глюкоза натощак (мг / дл) / 405 [17]. Учитывалось более пяти определений HOMA в различных ситуациях. Производная HOMA β-клеточная функция (HOMA-B%) также рассчитывалась по следующей формуле: 20 × инсулин натощак (мкЕд / мл) / глюкоза натощак (ммоль / л) - 3.5 [17]. Строгое значение HOMA> 2 было введено как предел наличия инсулинорезистентности [18]. Мы рассчитали количественный индекс проверки чувствительности к инсулину (QUICKI) как 1 / [log (инсулин натощак мкЕд / мл + log (глюкоза натощак мг / дл)] с диапазоном от 0,45 у здоровых людей до 0,30 у диабетиков [19].

Характеристики ультразвукового исследования

измерений в США были получены с помощью системы Esaote (Генуя, Италия). Классификация «яркой печени» или стеатоза печени (HS) была основана на следующей шкале гиперэхогенности: 0 = отсутствует, I = светлый, 2 = умеренная, 3 = тяжелая, что указывает на разницу между плотностью печени и правой почки [20] с использованием конвексного зонда с доступом к печени через межреберные промежутки по средней подмышечной линии.Поперечное сканирование выполняли для измерения подкожной жировой ткани (SAT) и висцеральной жировой ткани (VAT) с использованием линейного зонда с конвексом на одиннадцать и 3,5 МГц соответственно. SAT определялся как толщина между границей раздела кожа-жир и белой линией, избегая сжатия, оцениваемая на верхнем тертиле ксифо-пупочной линии. VAT был определен как расстояние между передней стенкой аорты и внутренней поверхностью прямокишечно-брюшной мышцы перпендикулярно аорте, измеренное на один см выше пупка.Когда стенки аорты не визуализировались, поскольку они были закрыты кишечным газом, использовалось доплеровское сканирование [21].

УЗИ мышц, выполняемое на уровне двуглавой мышцы плеча левой верхней руки, представляет собой удобный метод визуализации патологической мышечной ткани, поскольку он обеспечивает результаты в режиме реального времени. Инфильтрация жировой и фиброзной тканей увеличивает интенсивность мышечного эхо-сигнала; то есть на ультразвуковом изображении мышцы становятся белее [22]. Чтобы описать интенсивность мышечного эхо-сигнала, Хекматт и его коллеги разработали визуальную шкалу оценки, в которой степень I представляла нормальные мышцы, а степень IV представляла сильно увеличенную интенсивность мышечного эхо-сигнала с полной потерей эхо-сигнала костей (мы выбрали двуглавую мышцу плеча вместо плечевой кости [23].Уровни яркости печени и двуглавой мышцы плеча, полученные с помощью одного изображения поперечного сечения, были рассчитаны три раза непосредственно из замороженных изображений. Выбор оценки результатов одного поперечного изображения был сделан в соответствии с Jenkins et al., Которые продемонстрировали, что однократное поперечное изображение и панорамное УЗИ сопоставимы [24].

Непрямая калориметрия

RMR измеряли с помощью непрямой калориметрии с использованием навесной системы (V макс. 29 Н, Sensor Medics, Анахайм, США) в тихой обстановке и с пациентами в положении лежа на спине в течение 30 минут перед измерением.После 15–20 мин адаптации прибора в течение 45 мин определяли потребление кислорода и продукцию углекислого газа. Расход энергии был рассчитан на основе производства CO 2 и потребления O 2 с использованием соответствующей формулы Вейра без учета окисления белка [25]. BMR, выраженный в ккал / 24 ч, был скорректирован с учетом изменений в массе без жира (FFM), которые оценивали с помощью одночастотного биоимпедансного анализа (BIA), получая соотношение RMR / FFM, выраженное как ккал / 24 ч * кг массы тела. тело. Масса жира и процентное содержание FFM были оценены с использованием стандартных уравнений устройства, встроенных в уравнения прогнозирования, и отображались на машине и распечатывались [26].

Оценка BIA проводилась между 10:00 утра. и 16:00. Перед оценкой BIA участники должны были голодать и избегать энергичных упражнений в течение как минимум 1 часа. Измерения BIA проводились, когда пациенты стояли босиком на металлической поверхности устройства, держа руки свободно и параллельно телу. Измерение длилось 1-2 минуты для каждого пациента, а результаты автоматически распечатывались с устройства. Процентное содержание жира в организме, FFM и общая вода в организме были измерены с помощью BIA.Измерения были записаны хорошо обученным персоналом с использованием BIACorpus RX 4000 (Medi-Cal Healthcare GmbH, Карлсруэ, Германия). Саркопеническое ожирение определялось за вычетом двух нижних квинтилей мышечной массы (<9,12 кг / м 2 у мужчин) и (<6,53 кг / м 2 у женщин) и двух самых высоких квинтилей жировой массы (> 37,16% у мужчин. ) и (> 40,01% у женщин) по данным NHANES II [27].

Контрольная группа

Хотя IFN-альфа 2 является одним из цитокинов / хемокинов, не обнаруженных ни в одной возрастной группе здоровых субъектов, либо потому, что они находятся ниже нижнего предела обнаружения, либо потому, что они не продуцируются [28], мы учли учитывать значения популяции из 38 молодых здоровых субъектов, чтобы уменьшить ошибку типа I.Контрольная группа также предоставила информацию при анализе разницы уровней IFN-гамма в группах.

Статистика

Данные, полученные из нормально распределенной совокупности, были даны как среднее плюс стандартное отклонение. Переменные, не имеющие нормального распределения или порядковые номера, выражаются как медиана плюс 25–75 межквартильный размах (IQR). Различие медиан оценивали с помощью теста Манна – Уитни. Двусторонняя перекрестная таблица была установлена ​​с помощью коэффициента корреляции Пирсона (хи-квадрат). Ранговый тест Краскела – Уоллиса на равенство населения использовался для оценки различий при работе с более чем двумя переменными.

Коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rho) использовался для анализа основной корреляции между некоторыми данными.

При одномерном анализе использовался линейный регрессионный анализ (обычный метод наименьших квадратов или OLS) для оценки коэффициента с его стандартной ошибкой, 95% доверительными интервалами (ДИ), t (t-значение) и R 2 . При подозрении на гетероскедастичность, т. Е. Когда существовали субпопуляции, которые имеют изменчивость, отличную от других в гомоскедастической модели, и обнаружив наличие нескольких выбросов, мы проанализировали корреляцию с помощью надежной регрессии, используя регрессию наименьших абсолютных отклонений (LAD). .

Контекстно был проведен анализ остатков, «график зависимости остатков от совпадений». Это диаграмма разброса остатков по оси y и подогнанных значений (оценочные ответы) по оси x. График использовался для обнаружения нелинейности, неравных дисперсий ошибок и выбросов.

Одновременная квантильная регрессия была применена как способ обнаружения более полезных прогнозных взаимосвязей между переменными (метод начальной загрузки). Квантильная регрессия более устойчива к ненормальным ошибкам и выбросам.

При множественной линейной регрессии добавлялся еще и коэффициент Бета (β).

Упорядоченная пробит-модель использовалась для оценки отношений между порядковой зависимой переменной (IMTG) или HS в США и набором независимых переменных. Эти порядковые переменные представляют собой категориальные и упорядоченные переменные, выраженные в виде оценки степени тяжести (I-IV) для первого или степени тяжести для второго [1,2,3]. Выходные данные показали коэффициенты, их стандартные ошибки, z-статистику (также называемую z-статистикой Вальда) и соответствующие P-значения.

В определенных обстоятельствах байесовский вывод вычислял апостериорную вероятность, выраженную как среднее значение, SD, стандартная ошибка Монте-Карло или MCSE, медиана и интервалы достоверности.

Чтобы выделить незначительные ненаблюдаемые смешивающие переменные, были приняты два метода: (i) Тестирование на посредничество проводилось как четырехэтапный подход, в котором было выполнено несколько регрессионных анализов; Значимость коэффициентов проверялась на каждом этапе для изучения так называемого косвенного эффекта [29].(ii) Метод инструментальных переменных (IV) был использован для оценки причинно-следственных связей. Действительный инструмент вызывает изменения в независимой переменной (ковариате), но не оказывает независимого воздействия на зависимую переменную, позволяя выявить причинное влияние независимой переменной на зависимую переменную. Инструмент - это переменная, которая сама по себе не входит в объясняющее уравнение, но коррелирует с эндогенными объясняющими переменными, зависящими от значений других ковариат.Тип модели - случайные эффекты, а оценщик - Балтаги – Чангоне.

Факторный анализ применялся для выявления структуры взаимосвязей между переменными, выбирая подмножество переменных, имеющих наивысшие корреляции с факторами главных компонентов. Чтобы выбрать подмножество переменных, сначала был выполнен скрининговый график Кеттелла с относительными собственными значениями для проверки реальных факторов, которых в результате получилось три. Во-вторых, извлечение основных компонентов привело к максимизации дисперсии (варимакс) вращения исходного пространства переменных.Критическое значение рассчитывали путем удвоения коэффициента корреляции Пирсона для 1% уровня значимости (5,152) / квадратный корень из пациентов минус 2 (n 78), то есть 0,583. Полужирным шрифтом будут выделены основные компоненты для любого отдельного фактора со значением выше критического.

Предлагается закрытая форма оценки уникальности (уникальной дисперсии). Он обладает желаемыми с аналитической точки зрения свойствами, т. Е. Согласованностью, асимптотической нормальностью и масштабной инвариантностью. Коэффициент корреляции согласованности (ρ c ), который измеряет точность и аккуратность, был принят для оценки степени парных наблюдений в США.

Мощность этого исследования была рассчитана на основе разницы средних уровней IFN-альфа и IFN-гамма между группой с ожирением и контрольной группой. Чтобы углубить этот аспект, был проведен дальнейший анализ мощности с использованием теста наклона линейной регрессии между уровнями IFN-альфа и оценками IMTG.

Stata 15.1, Copyright 1985–2017, была программой, по которой мы запускаем статистику.

Комбинированная фотолюминесценция и рамановская микроскопия для идентификации современных пигментов: пояснительные примеры на поперечных срезах с картин русского авангарда | Heritage Science

На рис. 2 показаны изображения трех образцов с картин Ларионова и Гончаровой в видимом и ультрафиолетовом диапазонах.Толщина стратиграфии составляет около 200 мкм и характеризуется нечетко выраженными слоями. Фактически, цвета переходят друг в друга, особенно в образцах L5 и G3, возможно, из-за стиля художников. Кроме того, количество различных цветов, включенных в эти образцы, ограничено: ярко-красный и желтый присутствуют во всех образцах, интенсивный синий и темно-зеленый смешиваются с другими цветами, в то время как белые имеют определенные границы по отношению к другим слоям. По УФ-изображениям можно увидеть дополнительные детали.В частности, внутри желтого и оранжевого слоев в образцах L5 и G3 видны голубоватые точки, которые увеличивают неоднородность этих образцов.

Рис. 2

Изображения стратиграфических микрообразцов L5, L6 и G3, полученные с помощью настольного оптического микроскопа при темнопольном освещении (слева) и в конфигурации эпифлуоресценции (справа). Слои выделены цифрой в кружке, а стратиграфия отображается с внутренним слоем картины внизу изображения

.

Образец L5

С помощью обычного микроскопа можно распознать три слоя в стратиграфическом образце L5 (рис.1). Сверху вниз первый слой (слой 1) состоит из двух оттенков желтых красок (светлого и темного), смешанных вместе с зеленоватым цветом, который проявляется в виде полос через слой. Ниже белый слой (слой 2), смешанный с коричневым, накладывается на крошечный синий слой (слой 3), где зерна синего пигмента грубо смешаны с белой краской. УФ-фотография (рис. 1) подчеркивает сложную и неоднородную морфологию желтого слоя с появлением красноватой и зеленоватой излучающих областей и соответствующим присутствием люминесцентных неоднородностей во всех слоях краски.Коричневый цвет не показывает видимого излучения, как и синий слой. УФ-изображение не подчеркивает никаких других деталей.

TRPL-микроскопия используется на образце L5 для обнаружения излучения, происходящего как в наносекундном, так и в микросекундном временных масштабах, как описано в разделе «Методы», что приводит к реконструкции связанных многоспектральных наборов данных. В качестве примера на рис. 3а показан набор данных с временной синхронизацией наносекунд. В наносекундной и микросекундной шкале времени различное спектральное поведение излучения каждого слоя может быть визуализировано путем объединения изображений, полученных в разных спектральных диапазонах, в представлении ложных цветов (рис.3б). В частности, изображение в ложных цветах образца L5 в наносекундной и микросекундной шкале времени показывает неоднородное излучение желтого слоя, состоящего из смеси желтых красок. Кроме того, в синем слое можно визуализировать излучение некоторых неоднородностей, невидимых при стандартной микроскопии в режиме темного поля и эпифлуоресценции.

Рис. 3

a Набор спектральных данных образца L5, полученный в наносекундном масштабе времени. На этикетке внизу каждого изображения указывается анализируемая спектральная полоса. b Ложные цветные изображения: шкала времени в нс (синий = 370–390 нм, зеленый = 455–495 нм и красный = 530–570 нм) и микросекундная шкала времени (синий = 530–570 нм, зеленый = 630–670 нм и красный = 830–870 нм). c Восстановленные спектры в выбранных областях интереса желтого, белого и синего слоев в разном масштабе времени по сравнению с эталонными образцами из Kremer Pigmente

Спектральный профиль люминесцентных пигментов в стратиграфии восстанавливается, достигая идентификации трех основных люминесцентных пигментов в образце L5.В деталях, желтый слой (слой 1) показывает короткое излучение (время жизни порядка нескольких нс) с пиком в спектральной области между 450 и 500 нм и микросекундное излучение в ближней ИК-области с пиком около 700 нм (рис. 3c). . Эти особенности могут быть связаны с присутствием желтой кадмиевой краски (Cd 1 − x Zn x S, 0 1 − x Se x , 0

Дополнительно, анализ комбинационного рассеяния света (таблица 1) показывает комбинированное присутствие хромата свинца и синего фталоцианина в желтом слое (см. Дополнительный файл 1), в то время как полосы комбинационного рассеяния кадмия не обнаруживаются при задействованном возбуждении. Стоит отметить, что на основе комбинационных колебаний мы можем сделать вывод, что обнаруженный фталоцианиновый пигмент представляет собой фталоцианин на основе меди, который в основном используется в качестве синего синтетического красителя. В белых слоях обнаруживаются только полосы Киновари Рамана. Наконец, синий слой представляет собой характерный пик комбинационного рассеяния синтетического ультрамаринового синего.Никаких других соединений на основе анализа комбинационного рассеяния света не обнаружено (рис. 4).

Таблица 1 Пигменты, идентифицированные в образце L5 на основе рамановской спектроскопии Рис. 4

Левая панель: точки анализа, исследованные с помощью рамановской микроскопии (выделены черными кружками над цветным изображением образца). Правая панель: Рамановские спектры образца L5. Слой 1 показывает присутствие хромата свинца (354 (s), 375 (m), 397 (w), 839 (vs) см, -1 ) и фталоцианинового синего (256 (m), 679 (s), 746 ( s) см −1 ) (см. также Дополнительный файл 1).Слой 2 показывает пик киновари при 250 см 9 · 1051 −1 9 · 1052. Слой 3 представляет собой пик на 548 см −1 , связанный с пигментом Ultramarine Blue

Образец L6

Второй проанализированный образец - L6 из коллекции Ларионова, который представляет более простую стратиграфию, чем два других образца. Ниже мы обобщаем полученные результаты. Ссылаясь на фиг. 2, ярко-красные слои (слой 1) расположены вверху и внизу белого слоя (слой 2). Центральное белое тело образца дополнительно имеет желтоватый оттенок и синий остаток.Как и в предыдущем образце, основной состав образца с точки зрения люминесцентных пигментов достигается с помощью анализа микровизуализации TRPL. Как показано на рис. 5, мы обнаружили интенсивное излучение из белых слоев, которое происходит в наносекундном масштабе времени в спектральных полосах 380–400 нм и в микросекундном масштабе времени в зеленых спектральных полосах (500–550 нм). Такое поведение излучения соответствует типичному излучению цинкового белого пигмента [24]. Помимо этого, мы можем наблюдать, что внутри центрального белого слоя и поверх красного слоя есть некоторые люминесцентные точки, характеризующиеся интенсивным излучением около 500 нм в наносекундном масштабе времени и инфракрасным излучением (700 нм) в микросекундах. закрытое окно.Этот эмиссионный отпечаток типичен для пигментов Cd-желтого цвета. Стоит отметить, что эти люминесцентные точки внутри демонстрируют некоторые неоднородности с точки зрения спектрального излучения в наносекундном масштабе времени, причем точки излучают на длине волны 450 нм, 475 нм или 500 нм в зависимости от их пространственного положения в белом слое, как показано на рис. 5c. Этот случай предполагает, что желтая полоса в белом слое состоит из смеси различных желтых кадмий (Cd 1 − x Zn x S, 0 Рис. 5

a Деталь образца L6, исследованного с помощью TRPL микроскопии. b Ложное цветное изображение в наносекундном масштабе времени (синий канал = 370–390 нм, зеленый канал = 480–530 нм и красный канал = 630–670 нм). c Ложное цветное изображение в наносекундной шкале времени, где синий = 430–470 нм, зеленый = 445–495 нм и красный = 480–530 нм. d Реконструированные спектры в выбранных областях интереса слоя 1 (красный) и слоя 2 (белый) в разном масштабе времени, идентифицированных как пигмент на основе кадмия (Cd 1 − x Zn x S) и цинковый белый пигмент (ZnO)

Результаты микро-рамановской спектроскопии кратко представлены в таблице 2. Метод позволяет идентифицировать киноварь в красных слоях, которые вместо этого характеризовались каким-либо излучением фотолюминесценции. В белом слое мы обнаруживаем полосы комбинационного рассеяния, соответствующие различным компонентам белого цвета: гидроцерусситу, гипсу и оксиду цинка (рис.6). Из-за высокой чувствительности комбинационного рассеяния света к присутствию киновари, остаток этого пигмента обнаруживается также в белом слое (рис. 6). Внешний слой, который показал своеобразное красноватое излучение в результате анализа ФЛ, имеет толщину 10 мкм, что ниже разрешения нашей рамановской системы по горизонтали. Из-за этого никакая материальная идентификация этого крошечного слоя была невозможна.

Таблица 2 Пигменты, идентифицированные в образце L6 на основе спектроскопии комбинационного рассеяния Фиг.6

Левая панель: точки анализа, исследованные с помощью рамановской микроскопии (выделены черными кружками над цветным изображением образца). Правая панель: Рамановские спектры образцов L6. Слой 1 показывает присутствие киновари (250 (против), 280 (ш-ш) и 343 (м) см -1 ). Слой 2 показывает пик гидроцеруссита (1050 см -1 ), гипса (1000 см -1 ) и оксида цинка (438 см -1 ). Кроме того, в слое 2

обнаружен остаток киновари (250 (с) см −1 ).

Проба G3

Разрез Гончарова G3 методом четкой стратиграфии не выполнен.Цвета переходят одно в другое в соответствии с живописной техникой художника. Основные цвета - белый, желтый, оранжево-желтый и темно-зеленый. В частности, слой 1 и слой 2 в основном состоят из темно-желтых и оранжевых пигментов; последний слой включает также темно-зеленую полосу. Слой 3 и слой 5 белые, первый с синими включениями, происходящими из тонкого слоя между слоями 2 и 3. Ярко-желтый пигмент (слой 4) разделяет два белых слоя. Эпи-флуоресцентная микроскопия не добавляет деталей к видимому микроскопическому изображению.

Измерения микровизуализации TRPL показывают, что в этой стратиграфии есть только два люминесцентных слоя, слой 3 и 5. Излучение ФЛ в наносекундном масштабе времени позволяет нам четко идентифицировать использование цинкового белила в качестве белого пигмента в обоих слоях. (Рис.7). Как показано в предыдущих примерах, его присутствие может быть легко обнаружено благодаря его типичной эмиссии ниже 400 нм, приписываемой прямой электронно-дырочной рекомбинации, и широкой зеленой эмиссии, связанной с состояниями ловушки. Помимо этого, слой 3 имеет дополнительное излучение, возникающее в микросекундном масштабе времени и достигающее максимума в ближней инфракрасной области, что является неожиданным для цинкового белого пигмента.Такое инфракрасное излучение характерно для рутилового полиморфа TiO 2 [26], используемого в качестве современного белого пигмента с середины двадцатого века.

Рис. 7

a Деталь образца G3, исследованного с помощью микроскопии PL. b Реконструированные спектры в выбранных областях интереса слоя 3 и слоя 5 (два белых), идентифицированных как цинковый белый пигмент со следами титанового белила в слое 3. c Ложные цветные изображения: стробируемое изображение наносекундной шкалы времени (370–390 нм) и изображение со стробированием в микросекундной шкале времени (BP450 / 40 слева, BP750 / 40 справа)

Рамановская спектроскопия проводится для подтверждения такой гипотезы.Результаты (таблица 3) показывают, что, как и ожидалось, два белых слоя характеризуются разными колебательными модами. Во-первых, в слое 5 подтверждается присутствие цинкового белила в качестве основного пигмента. Никаких других компонентов в этом слое не обнаружено. На обороте слой 3 имеет типичный отпечаток анатаза, наложенный на белый цинковый пик, как показано на рис. 8. Наконец, рамановская спектроскопия распознает хромат свинца в желтом слое (слой 4), который вместо этого не имеет люминесцентного излучения.

Таблица 3 Пигменты, идентифицированные в образце G3 на основе спектроскопии комбинационного рассеяния Фиг.8

Левая панель: точки анализа, исследованные с помощью рамановской микроскопии (выделены черными кружками над цветным изображением образца). Правая панель: Рамановские спектры образцов G3. Слой 3 показывает присутствие анатаза (147 (vs), 198 (vw), 396, 515, 640 см -1 ). Слой 5 состоит из оксида цинка (332 (w), 383 (w) 438 (s) см 9 · 1051 -1 ), тогда как слой 4 состоит из хромата свинца (354 (s), 375 (m), 397 (w) ), 839 (vs) см −1 )

MxB представляет собой индуцированный интерфероном фактор рестрикции вирусов герпеса человека

Клеточные линии

Клетки глиобластомы человека T98G (CRL-1690), клетки аденокарциномы легкого человека A549 (CRM-CCL-185), эпителиальные клетки почек африканской зеленой обезьяны Vero E6 ( CRL-1586), HEK-293T (CRL-11268) и клетки HeLa (CCL-2) были приобретены в ATCC.Клетки культивировали в среде роста (среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM, с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 200 мкМ GlutaMAX, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Life Technologies)) при 37 ° С. ° C и 5% CO 2 . Первичные HUVEC (CRL-1730, ATCC, любезно предоставленные Mirco Ponzoni, IRCCS Istituto G. Gaslini, Genova, Италия) культивировали на чашках, предварительно покрытых коллагеном, полученным из сухожилия хвоста крысы (Merck), в среде HUVEC (эндотелиальный эндотелий EBM-2). базальная среда для роста (CC-3156, Lonza) с добавкой EGM-2 Endothelial Growth SingleQuot Kit и факторами роста (CC-4176, Lonza)) при 37 ° C и 5% CO 2 .Для создания стабильно трансдуцированных клеточных линий A549 и Vero полноразмерные Schistosoma japonicum GST ( GSTM1 , номер доступа FN315690.1) и полноразмерные Homo sapiens MX2 (номер доступа nM_002463.1) комплементарны ДНК (кДНК) клонировали в вектор лентивирусной экспрессии pLVX-IRES-Puro (Clontech) с использованием сайтов рестрикции Xho I и XBa I для получения pLVX-GSTM1-IRES-Puro или Xh oI и Not I сайтов рестрикции для получения pLVX-MX2-IRES-Puro.Лентивирусные частицы получали в клетках HEK-293T с помощью pCMVR8.91-Gag-Pol и pVSV-G (Clontech) вместе с конструкциями для лентивирусной экспрессии. Клетки A549 и Vero трансдуцировали упакованными экспрессионными векторами, отбирали клоны с высокой экспрессией генов и поддерживали их 5 мкг / мл пуромицина (Invivogen). В качестве контроля качества идентичность стабильных клонов A549 и Vero была подтверждена секвенированием.

Плазмиды

Для экспериментов по временной сверхэкспрессии были клонированы полноразмерные кДНК GSTM1 и MX2 плюс фрагмент кДНК, кодирующий короткую изоформу MxB (MxB Δ1–25, пары оснований 76–2148 из MX2 кДНК). в pCDNA3.Вектор экспрессии 1-Neo (+) (Invitrogen) с использованием сайтов рестрикции Not I и Xba I. Мутантные векторы MX2 (G51Q) и MX2 (T151A) были созданы с помощью сайт-направленного мутагенеза (QuikChange II XL, Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Репортерная плазмида pGL-T9G, специфичная для герпесвируса, была ранее описана 60 .

Вирусы

Все вирусы, использованные в этом исследовании, кроме KSHV, были выращены на клетках A549 при 37 ° C и 5% CO. 2 , и их инфекционные титры были определены на клетках A549 (выражены как средняя инфекционная доза для тканевой культуры, TCID 50 , по оценке по методу Спирмена – Кербера), если не указано иное.Штамм HSV-1 MacIntyre (VR-539) и штамм F (VR-733) были приобретены в ATCC. Штамм C12 HSV-1 был ранее описан 48 и любезно предоставлен S. Efstathiou (Кембриджский университет, Кембридж, Великобритания). Штамм G HSV-2 (ATCC, VR-734) выращивали при 34,5 ° C и 5% CO 2 . Штамм IAV WSN (A / WSN / 1933 (h2N1)) выращивали и титровали с помощью анализа бляшек на клетках почек собак Madin-Darby в присутствии 0,5 мкг / мл трипсина, обработанного тозилфенилаланилхлорметилкетоном (TPCK) (Sigma-Aldrich) .HAdV-C5 (wt300) ранее был описан 29 . Рекомбинантный вирус герпеса, связанный с саркомой Капоши (rKSHV.219 51 ), был получен из клеток BrK.219 72 (щедро предоставленных Томасом Шульцем, Ганноверская медицинская школа, Ганновер, Германия), обработанных средой 1640 Мемориального института Парка Розуэлла (RPMI). (Life Technologies), содержащий 0,625 мкг / мл античеловеческих IgM (специфичных для μ-цепи, Southern Biotech), 0,05 мкг / мл 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата и 8% FBS. Бесклеточные супернатанты центрифугировали при 30000 × g и 4 ° C в течение 2 часов, и титры вирусных концентратов определяли с помощью проточного цитометрического анализа GFP-положительных клеток HEK-293T через 48 часов.я. на FACSCanto II (BD Biosciences). Меченый EdC геном HSV-1 был получен и очищен следующим образом. Клетки A549 инфицировали штаммом F HSV-1 с низкой MOI и инкубировали до развития полного цитопатического эффекта. EdC добавляли к клеткам при 4 ч p.i. до конечной концентрации 2,5 мкМ. EdC синтезировали, как описано 73 . Собирали внеклеточную среду и клеточный дебрис удаляли низкоскоростным центрифугированием. Супернатант, содержащий вирус, центрифугировали при 27 500 × g и 4 ° C в течение 90 мин.Полученные осадки ресуспендировали осторожным встряхиванием в течение ночи при 4 ° C в буфере MNT (30 мМ 2- ( N -морфолино) этансульфоновая кислота, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH = 7,4). После обработки ультразвуком (трижды по 30 с каждый при 4 ° C) суспензию наслаивали на прерывистый градиент Nycodenz ® (20% и 30% Nycodenz ® , SERVA Electrophoresis GmbH, Гейдельберг) и центрифугировали при 140000 × г и 4 ° C в течение 2 часов. Полосу, содержащую вирус, скопившуюся на границе раздела, собирали, разделяли на аликвоты, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.

РНК-интерференция

Трансфекцию миРНК проводили с использованием реагента Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) в соответствии со стандартным протоколом обратной трансфекции производителя, если не указано иное. Вкратце, комплексы для трансфекции получали с использованием 30 нМ миРНК и 1 мкл реагента для трансфекции в 24-луночном формате, если не указано иное. Клетки в суспензии добавляли к комплексам и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C. Комплексы трансфекции удаляли промыванием фосфатно-солевым буфером (PBS), и клетки инкубировали еще 24 ч в среде для выращивания.SiRNA, используемые в этом исследовании, были приобретены у Qiagen (siNT, пользовательская siRNA, целевая последовательность 5'-AAG CGT TCG TCC TAT GAT CGA-3 '; siMxB UTR, каталожный номер SI00038206, целевая последовательность 5'-CAG CAT TGT AAC TGC TTA ATA-3 '; siMxB # 1, каталожный номер SI00038220, целевая последовательность 5'-TAG GCA TAC TTG CAA CTA ATA-3'; siRPS27A, пользовательская siRNA, целевая последовательность 5'-GCT GGA AGA TGG ACG TAC T -3 ') и Dharmacon (siMxB # 2, каталожный номер D-011736-01, целевая последовательность 5'-GAG CAC GAU UGA AGA CAU A-3').

Непрямые иммунофлуоресцентные анализы

Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 3% (мас. / Об.) Параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 10 мин.Последующую проницаемость и окрашивание антител проводили с использованием PBS с добавлением 50 мМ NH 4 Cl, 0,1% (мас. / Об.) Сапонина и 2% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (BSA, Roth AG, Arlesheim). В качестве первичных используемых антител были козьи анти-MxB (Santa Cruz Biotechnology, sc-47197, 1:50), мышиные анти-HSV-1/2 VP5 (Abcam, ab6508, 1: 200), кроличьи поликлональные антитела против HC (PAb). (направлено против очищенных ДНК-содержащих капсидов HSV-1, любезно предоставлено Р. Эйзенбергом и Дж. Коэном, Университет Пенсильвании, Филадельфия, США, 1: 1000) и крысиные анти-LANA (Advanced Biotechnologies Inc., №13-210-100, 1: 500). В качестве вторичных антител использовали ослиный анти-козий IgG, связанный с Alexa Fluor 488, козий анти-мышиный IgG-AF568, козий анти-кроличий IgG-AF568 и / или козий анти-крысиный IgG-AF555 (все от Life Technologies, 1: 1000) . ДНК контрастировали с использованием Hoechst 33342 (Life Technologies, 1: 5000). Флуоресцентные изображения были записаны на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5 (Leica Microsystems), обслуживаемом Центром микроскопии и анализа изображений Цюрихского университета. Для визуализации локализации MxB в клетках T98G была применена деконволюция с использованием версии 17 Гюйгенса.04.

Обработка IFN перед вирусной инфекцией

Клетки T98G обрабатывали 500 МЕ / мл рекомбинантного человеческого IFN-α2 (Roferon-A, Roche Pharmaceuticals) за 18 ч до вирусной инфекции. Во время и после инокуляции вируса IFN не вводили.

Инфекция клеток T98G и линий эпителиальных клеток

Если не указано иное, клетки инокулировали указанным MOI в инфекционной среде (DMEM, высокое содержание глюкозы, с добавлением 0,2% (мас. / Об.) BSA, 20 мМ 4- [2- гидроксиэтил] -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), 200 мкМ GlutaMAX, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific)) в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали PBS и затем выдерживали в среде инфекции при 37 ° C и 5% CO 2 в течение указанных периодов времени.Для IAV после инокуляции к инфекционной среде добавляли 0,5 мкг / мл трипсина, обработанного TPCK (Sigma-Aldrich). Для HAdV-C5 клетки инокулировали при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 120 минут в 2% среде FBS (DMEM, высокое содержание глюкозы, с добавлением 2% FBS, 200 мкМ GlutaMAX, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкМ пенициллина). мкг / мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific)). Клетки дважды промывали 2% средой FBS, а затем инкубировали с 2% средой FBS при 37 ° C и 5% CO 2 . HAdV-C5 определяли количественно из внутриклеточного и внеклеточного вируса, полученного путем соскабливания клеток в супернатант культуры, мгновенного замораживания в жидком азоте и лизиса с тремя последовательными циклами замораживания-оттаивания.Лизаты центрифугировали при 1000 × g в течение 5 мин и титровали на свежих клетках A549. Количество инфекционных частиц на мл определяли путем фиксации клеток в 4% (мас. / Об.) PFA через 21 час, гашения 25 мМ NH 4 Cl, повышения проницаемости 0,5% Triton X-100 и иммуноокрашивания кроличьим антибелком VI. антитело 74 . Для штамма C12 HSV-1 инфицированные клеточные культуры поддерживали в среде 2% FBS, и флуоресценцию GFP контролировали с интервалами 1-3 ч с использованием системы анализа живых клеток IncuCyte Zoom (Essen Bioscience).Для HSV-2 инокуляцию проводили в 2% среду FBS в течение 60 минут при 34,5 ° C и 5% CO 2 . Затем клетки промывали PBS и инкубировали со средой 2% FBS при 34,5 ° C и 5% CO 2 . Для определения титров вирусов IAV, VSV, HSV-1 и HSV-2 супернатанты от инфицированных клеточных культур центрифугировали при 1500 × g, и 4 ° C в течение 10 минут и титровали на свежих клетках A549 с использованием анализа TCID 50 . Для KSHV клетки спинокулировали в течение 1 ч при 800 × г и 4 ° C в среде для выращивания, а затем сдвигали до 37 ° C и 5% CO 2 .Через 48 ч p.i. клетки фиксировали 1% (мас. / Об.) PFA, и экспрессию GFP измеряли на проточном цитометре LSR II Fortessa (BD Biosciences) и анализировали с использованием FlowJo версии 10.2.

Додецилсульфат-полиакриламид натрия

гель Электрофорез и иммуноблот-тесты

Клетки промывали ледяным PBS и лизировали радиоиммунопреципитационным буфером (20 мМ Tris-HCl, pH = 7,4, 100 мМ NaCl, 1% NP- 40, 0,1% (мас. / Об.) Додецилсульфат натрия, 1% (мас. / Об.) Дезоксихолат натрия, 50 мМ NaF, 50 мМ β-глицерофосфат, 1 мМ Na 3 VO 4 , 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота, 1 мМ дитиотреитол и коктейль с ингибитором протеазы cOmplete ™ (Roche Applied Science)) в течение 10 мин на льду.Лизаты очищали с использованием спин-колонок QIAshredder (Qiagen), кипятили в буфере Лэммли и разделяли на 4–12% полиакриламидных гелях NuPAGE ™ (Invitrogen). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивали с использованием следующих антител: козлиных анти-MxB (Santa Cruz Biotechnology, sc-47197, 1: 500), кроличьих анти-MxA (Novus Biologicals, H00004599-D01P, 1: 1000), мышиных. Моноклональные антитела против HSV-1/2 VP16 LP1 75 (любезно предоставлены A. Minson и H. Browne, Кембриджский университет, Великобритания, 1: 5000), кроличьи анти-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, sc- 25778, 1: 3000) и мышиные анти-GST (Santa Cruz Biotechnology, sc-57753, 1: 1000).Денситометрический анализ проводился с использованием MultiGauge версии 3.0. Значения были нормализованы к контролю нагрузки и представлены относительно соответствующего контрольного условия. Необработанные снимки всех иммуноблотов можно найти на дополнительных рисунках. 8–12.

Экстракция РНК и RT-qPCR HSV-1

Общая РНК из инфицированных клеток A549-GST и A549-MxB была получена лизисом в реагенте TRIzol ® (Invitrogen) и экстракцией РНК с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen) инструкции производителя.ДНК расщепляли ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific) и синтез кДНК выполняли с использованием случайных праймеров (Promega) и системы синтеза первой цепи SuperScript III для ОТ-ПЦР (Invitrogen). кДНК вирусных транскриптов количественно определяли с помощью кПЦР с использованием гена GAPDH в качестве эндогенного контроля и праймеров, специфичных для генов RL2 , RS1 и UL29 с использованием SYBR green (Life Technologies). Последовательности кДНК HSV-1 амплифицировали в следующих условиях: 3 мин при 95 ° C, 39 × (15 с при 95 ° C, 60 с при 45 ° C), 10 с при 95 ° C, 5 с при 65 ° C. , 5 с при 95 ° С.Были использованы следующие праймеры (в 5'– 3'-ориентации): RL2 - вперед: CCT GTC GCC TTA CGT GAA CA и RL2 - обратный: ACA CGG ATT GGC TGG TGT AG; RS1 - вперед: GTG AGA CCC GAA GAC GCA AT и RS1 - назад: CAT CTC TAC CTC AGT GCC GC; UL29 - вперед: TGG CTT TTC GGA CTA CAC CC и UL29 - назад: TTC GAA GGC CGT GAA CGT AA; GAPDH - вперед: GAA GGT GAA GGT CGG AGT C и GAPDH - назад: GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC.Значения Ct были нормализованы к GAPDH (ΔCt), а относительные уровни мРНК вируса были рассчитаны с использованием метода 2 - ΔΔCt .

Анализы экспрессии белка HSV-1 и воздействия VP5 HSV-1

Клетки A549-GST и A549-MxB инокулировали штаммом F HSV-1 с указанной MOI в 2% среде FBS в течение 60 мин на льду в присутствии или отсутствие циклогексимида 100 мкг / мл (Sigma-Aldrich). Инокулят удаляли и заменяли средой 2% FBS с циклогексимидом 100 мкг / мл или без него.Клетки инкубировали при 37 ° C в течение указанных периодов времени, дважды промывали PBS и фиксировали 3% (мас. / Об.) PFA в PBS в течение 10 мин. Фиксированные образцы подвергали проницаемости 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут, промывали три раза и затем блокировали 5% козьей сывороткой в ​​течение 30 минут при комнатной температуре. Главный капсидный белок HSV-1 окрашивали с использованием мышиных антител против HSV-1/2 VP5 (Abcam, ab6508, 1: 200). Для окрашивания белков раннего и раннего HSV-1, кроличьи анти-ICP0 PAb (любезно предоставлены Беном Хейлом, 1: 100), мышиные анти-ICP4 (Abcam, ab6514, 1: 2500) и мышиные анти-ICP8 (Abcam , ab20193, 1: 100) антитела.В качестве вторичных антител использовали козий анти-кроличий IgG-AF488 или козий антимышиный IgG-AF488 (Life Technologies, 1: 1000). ДНК контрастировали с использованием Hoechst 33342 (Life Technologies, 1: 5000). Флуоресцентные изображения были записаны на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5 (Leica Microsystems), обслуживаемом Центром микроскопии и анализа изображений Цюрихского университета. Для количественной оценки воздействия VP5 определяли интересующую область (ROI) вдоль центральной фокальной плоскости вокруг каждого ядра клетки (определяемую контрастным окрашиванием ДНК и впоследствии увеличенную, чтобы покрыть цитоплазму вокруг него), и количественно оценивали VP5-положительные очаги в каждой области интереса. .Для количественной оценки экспрессии белков ICP0, ICP4, ICP8 и VP5 de novo в ранние моменты инфицирования определяли среднюю интенсивность флуоресценции в ядре (определяемую контрастным окрашиванием ДНК). Все данные были количественно определены с использованием специально созданных макросов ImageJ версии 1.48.

Анализ капсида HSV-1 и локализации генома

Клетки A549-GST и A549-MxB инокулировали штаммом F HSV-1, меченным EdC, в течение 1 ч на льду с постоянным покачиванием в среде RPMI 1640 (Life Technologies), содержащей 0.2% (мас. / Об.) BSA и 20 мМ HEPES для связывания вируса. По истечении этого периода клетки дважды промывали свежей средой и либо фиксировали сразу в 4% (мас. / Об.) PFA в PBS, либо фиксировали через определенные промежутки времени после инкубации при 37 ° C и 5% CO 2 в присутствии 100 мкг / мл циклогексимида (Sigma-Aldrich) для предотвращения синтеза вирусных белков. Для обнаружения поступающих капсидов клетки окрашивали кроличьим анти-HC PAb. После иммуноокрашивания вирусные геномы визуализировали с использованием катализируемого медью (I) азид-алкинового циклоприсоединения (щелчок), как описано ранее 28 .Вкратце, образцы окрашивали в течение 2 часов при комнатной температуре свежеприготовленной смесью для окрашивания Click Chemistry, содержащей 10 мкМ AF488-азида (Life Technologies), 1 мМ CuSO 4 (Sigma-Aldrich), 10 мМ аскорбата натрия (Sigma-Aldrich). , 10 мМ аминогуанидин (Sigma-Aldrich) и 1 мМ трис (гидроксипропилтриазолил) метиламин (Sigma-Aldrich). Образцы окрашивали 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Life Technologies) для ядер клеток и сукцинимидиловым эфиром-AF647 (Life Technologies) для определения контуров клеток и заливали в среду DAKO (Dako Schweiz AG, Baar).Флуоресцентные изображения были записаны на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS SP8 (Leica Microsystems), принадлежащем Центру микроскопии и анализа изображений, Университет Цюриха. Изображения были проанализированы с использованием специализированного конвейера CellProfiler версии 2.1.1 и KNIME версии 2.12.2.

Просвечивающая электронная микроскопия

Клетки A549-MxB, предварительно обработанные siRNA, спинокулировали штаммом MacIntyre HSV-1 (MOI = 500, исходный вирус вируса продуцирован в среде 2% FBS и дополнен 20 мМ HEPES перед инокуляцией) при 800 × г. и 4 ° C в течение 60 мин в присутствии 100 мкг / мл циклогексимида (Sigma-Aldrich).Инокулят удаляли и клетки инкубировали в среде для инфицирования в присутствии 100 мкг / мл циклогексимида в течение 3 часов. Образцы обрабатывали для ПЭМ и анализировали при помощи ПЭМ на Zeiss EM 902A с модификациями ранее опубликованных протоколов 76 . Перед фиксацией клетки дважды промывали теплым PBS, содержащим 1 мМ CaCl 2 и 0,5 мМ mgCl 2 (PBS + Ca / Mg). Клетки фиксировали 2% глутаровым альдегидом в PBS + Ca / Mg в течение 30 мин при комнатной температуре. Подготовку образцов для ПЭМ проводили следующим образом.Постфиксация : короткая промывка в PBS, 3 × промывка в H 2 O в течение 5 мин, инкубация с 1% тетроксидом осмия + 1,5% феррицианидом калия в H 2 O при 4 ° C в течение 1 ч, 3 × отмывка в PBS в течение 3 минут, 2 × отмывка в H 2 O в течение 5 минут и инкубация с 2% уранилацетатом в H 2 O в течение ночи при 4 ° C. Дегидратация образца: 30% ацетон в течение 5 минут, 50% ацетон в течение 5 минут, 70% ацетон в течение 30 минут, 90% ацетон в течение 10 минут, 100% ацетон в течение 5 минут и 100% ацетон в течение 10 минут.Заливка образца: 48% эпоксидной смолы, 16% додеценилянтарного ангидрида, 34% метилнадиевого ангидрида и 2% бензилдиметиламина. Смоле позволяли полимеризоваться при 60 ° C в течение 2 дней. Установка образцов, окрашивание и визуализация: ультратонкие срезы (85 нм), полученные с помощью ультрамикротома Leica Ultracut UCT (Leica Microsystems), помещали на медные сетки с поддерживающей пленкой парлодион-углерод, помещая сбоку на каплю 2% уранилацетата в H 2 O на 30 минут, многократно погружали в H 2 O, сушили на воздухе в течение ночи, помещали боком на каплю раствора для окрашивания свинца Сато на 20 минут, многократно погружали в H 2 O, сушили на воздухе в течение 30 минут и изображение получено при 80 кВ и увеличении × 50 000.

Репортерный анализ люциферазы герпесвируса

Временные трансфекции проводили с использованием реактива jetPRIME ® (Polyplus Transfection) в соответствии с инструкциями производителя. Комплексы для трансфекции получали при соотношении ДНК: реагент для трансфекции 1: 2 с общим количеством 500 нг ДНК на лунку (формат анализа 24-луночного планшета). В частности, использовали 200 нг pGL-T9G и возрастающие количества экспрессионных плазмид (37,5, 75 и 150 нг). Общее количество ДНК на лунку доводили с использованием пустой экспрессионной плазмиды.После периода инфицирования активность люциферазы определяли с использованием системы анализа люциферазы BrightGlo ™ (Promega) на планшет-ридере Envision 2104 (Perkin Elmer).

Временная сверхэкспрессия для анализа локализации MxB

Временные трансфекции для иммунофлуоресцентного анализа вариантов MxB выполняли с использованием реагента ViaFect ™ (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Комплексы для трансфекции получали при соотношении ДНК: реагент для трансфекции 1: 3 с общим количеством 500 нг экспрессионной плазмиды на лунку (формат анализа 24-луночного планшета).

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием R версии 3.4.1 77 . Индивидуальные статистические тесты указаны в подписях к рисункам. Данные подсчета с более чем двумя группами анализировали с помощью критерия Краскела – Уоллиса и попарного критерия суммы рангов Вилкоксона. Все остальные сгруппированные данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с учетом предположений о нормальности и однородности дисперсии 78 . Множественные сравнительные тесты с заданными пользователем контрастами были выполнены с помощью функции glht в пакете multcomp.Для неортогональных множественных сравнений уровни α корректировались в соответствии с методом Холма 79 .

Доступность кода

Компьютерный код, используемый для количественной оценки иммунофлуоресцентного изображения, доступен на https://github.com/greberlab/2018_NatComm_MxB.

Доступность данных

Авторы заявляют, что данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны в статье и файлах с дополнительной информацией или по запросу.

Сравнительное исследование двух различных методов выявления латентного туберкулеза у ВИЧ-положительных лиц в Чили

Резюме

Цель

Сравнить эффективность двух тестов для диагностики латентной туберкулезной инфекции (ТБ) у ВИЧ-инфицированных. населения Чили, чтобы лучше идентифицировать субъектов, которым может помочь химиопрофилактика туберкулеза.

Дизайн

Это было перекрестное исследование среди лиц, посещающих три амбулаторные клиники по борьбе с ВИЧ в Сантьяго, протестировано с 2-TU очищенным производным белка, QuantiFERON ® -TB Gold «in-tube» (QFT-G), и рентген грудной клетки.

Результаты

Всего в исследовании было задействовано 116 субъектов со средним числом CD4 393 клеток / мкл (диапазон 100–977). Туберкулиновый кожный текст (TST; отсечение 5 мм) и результаты QFT-G были положительными у 10,9% и 14,8% пациентов, соответственно, с умеренным соответствием между обоими тестами (каппа = 0.59). Наличие в анамнезе известного заражения ТБ (отношение шансов (ОШ) 3,46, 95% доверительный интервал (ДИ) 1,02–11,22) и перенесенного ТБ (ОШ 4,31, 95% ДИ 1,13–15,5) были связаны с положительным результатом QFT-G. Только перенесенный ТБ был достоверно связан с положительным результатом ТКП (OR 6,63, 95% ДИ 1,62–26,3). Среди субъектов с TST <5 мм 8,2% дали положительный результат по тесту QFT-G. Эти люди имели более низкое среднее количество клеток CD4, чем те, которые были обнаружены положительными в обоих тестах (328 клеток / мкл и 560 клеток / мкл, соответственно, p = 0.03).

Выводы

В этой популяции ВИЧ-инфицированных людей QFT-G и TST показали приемлемый уровень согласия, хотя QFT-G, по-видимому, меньше подвержен влиянию более продвинутой иммуносупрессии.

Ключевые слова

Туберкулез

Скрытый туберкулез

Диагностика

Кожная туберкулиновая проба

ВИЧ

Интерферон-гамма

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

View Abstract

International Disease.Опубликовано Elsevier Ltd. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *